多聚酶链式反应扩增DNA片段_培训课件.pptVIP

* 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 巍山二中 2012-4-16 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术概论 一、基础知识 （一）回忆DNA的复制 1、发生时间： 发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期。 2、特点(方式)： 边解旋边复制 半保留复制 多起点复制 3、合成条件 模板： 原料： 游离的脱氧核苷酸 DNA两条链 能量： ATP 酶: 解旋酶、DNA聚合酶 反应条件温和 4、场所： 细胞核(主)、线粒体、叶绿体 (二）PCR原理及条件 1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。 多聚酶链式反应 DNA 2．DNA的平面结构： A G C T 5端 3端 氢键 A T G C 3端: -OH端 5端:磷酸基团的末端 注意：1、DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3‘端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物 2、DNA的合成方向总是从子链的5‘端向3‘端延伸 （1）、 DNA 分子的热变性原理 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃） 复性（缓慢冷却） 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物与两条单链结合 在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 3、PCR原理 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 （2）、步骤：变性 ——复性——延伸 （3）、PCR 反应的条件 ①DNA模板； ②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）； ③四种脱氧核苷酸； ④耐高温的聚合酶（Taq DNA聚合酶）； ⑤控制温度，但不需解旋酶； ⑥需要在一定的缓冲液中进行。 二、PCR的反应过程 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 每个循环包括：变性 ——复性——延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 PCR的反应过程总结 三、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 三、 PCR反应的实验操作 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C,10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： （6）、注意事项 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头 四、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释→对照调零→ 测定→计算（ DNA含量（?g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数） 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 *