变性高效液相色谱技术及其在植物检疫工作中的应用前景.doc

变性高效液相色谱技术 及其在植物检疫工作中的应用前景 2011-2012学年第一学期 课程名称：仪器分析 变性高效液相色谱技术及其在植物检疫工作中的应用前景 摘要：本文介绍了变性高效液相色谱(DHPLC)技术的基本原理及影响因素，并结合植物病原鉴定技术的特点，分析了DHPLC技术在植物检疫工作中的应用前景，证明了DHPLC技术将成为一种快速、准确、高效的新型植物病原检测技术。 关键词： DHPLC 植物检疫 核酸分析技术 DHPLC是变性高效液相色谱(denaturing higperformance liquid chromatography)的英文缩写，是近几年才逐渐发展成熟的核酸分析技术，目前在生命科学领域中已得到广泛的应用。是一种基于异源双链分析(heteroduplex analysis)的基因突变、单核苷酸多态性(SNP)、DNA片段长度多态性的高精度、高通量的新型检测技术。 植物检疫工作中，由于植物病原特殊的生物学特点，而具有原理、步骤程序各不相同、种类繁多的鉴定技术。大多数病原如病原细菌、病毒、类病毒在传统的目测法、培养基筛选、免疫电镜、血清学鉴定等步骤后，还需进行指示植物鉴别及致病力检测。其步骤繁杂，时间冗长甚至超出苗木存活容许的时间范畴等缺陷给检验检疫工作的顺利实施造成了一定的困难。变性高效液相色谱技术(DHPLC)的出现为解决以上问题提供了极大的可能，这种技术利用基因的物理化学性质，将先进的高精度大型仪器分析技术与核酸提取、体外扩增等经典分子生物学技术相结合，实现了生物学、物理学、分析化学等多学科交汇互融，既发挥了化学仪器的高精密度的优势，又体现了物理学和生物技术的成果，是当今学科交叉领域又一杰出科研硕果，可为未来植物检疫技术发展提供了新的前进方向。 一、 DHPLC的基本原理及影响因素 1 长度多态性分析原理 DNA分子带负电荷，通过一种充当‘桥梁’作用的分子一使TEAA(三乙钱醋酸盐)的阳性按离子与DNA相互作用，与柱子固相填料表面分子结合，DNA分子本身得以吸附到柱子上。这样DNA分子结合的TEAA越多，与固相结合得越牢固。经基链与固相结合的强度会随着流动相中乙睛浓度的增加而减，DNA片段越长，结合的TEAA越多，越不易被洗脱。因此DNA片段大小分析是长度依赖性分离，而非序列依赖性分离。变性温度是影响DNA片段分析的一个重要因素。而在不变性温度条件下，可分离长度不同的双链DNA分子。 2 基因型多态性分析原理 DHPLC的基本原理是异源双链分析(heteroduplex analysis)。异源双链(heteroduplex)指由不完全互补的两条DNA单链形成的双链DNA，同源双链(homoduplex)指由完全互补的两条DNA单链形成的双链DNA简略来说，异源双链和同源双链对介质有不同的亲和力，因此，它们从介质中被洗脱下来的条件有差别。如果PCR产物源自纯合子或者发生了纯合突变的个体，那么只有在与另外一种纯合野生型序列的PCR产物混合，再变性复性，才能够形成上述杂合和纯合双链。杂合双链存在错配碱基，其变性温度低于纯合双链，当温度升高到一定程度，先于纯合双链在错配碱基周围解链变性，导致双链减少和单链增多。由于单链比双链所带的负电荷少，杂合双链比纯合双链更容易形成单链，其保留时间短于纯合双链，在图谱上先于未解链的纯合双链出现。随着变性温度升高，纯合双链也会部分变性，A=T含有2个氢键，C=G含有3个氢键，前者变性程度比后者低，因此先出现的峰为含有AT的双链，后出现的为含CG的双链。利用这种杂合和纯合双链在保留时间上的差异，可以快速分析单个核苷酸的突变，从而进行基因型的判定。 3 DHPLC的影响因素 （1）PCR产物的影响 PCR扩增为高通量基因型检测提供了标本源。DHPLC对PCR中的引物、试剂虽无特殊要求，而且也不必对PCR产物进行预处理，但是要尽量保证PCR扩增产物的忠实性，避免人为引入错配碱基。 （2） 洗脱温度 温度是影响DHPLC检测基因型成功与否的至关重要因素。如将检测温度提高2℃后，就可在RET基因中发现两个漏检的突变基因型。有些基因突变对温度不敏感，在较宽的温度范围内(悬殊8℃左右)都可对其进行有效筛检；但有的突变对温度要求严格一些，如BRCA1基因的56134C/T与 2640C/T，只有分别在59℃与57℃下，才能被检测到。 （3）固定相 目前，有几种不同的分离介质被用于突变分析中。如美国Transgenomic公司应用大小为2 m的无孔聚苯乙烯颗粒作为分离柱的材料，惠普公司则使用孔径为3.5 m的硅胶作为分离柱介质。这两种柱的分辨率似乎相似，但寿命却大不相同，前者通常可分析6000个左右的样品，而后者仅可分析1000~2000