实验二微生物基因组DNA提取和鉴定要素.pptVIP

* 实验二 微生物基因组DNA的提取和鉴定 * 学习并掌握从微生物中提取基因组DNA方法及其原理。 一、实验目的 二、实验原理 （1）微生物破碎细胞方法：溶菌酶、SDS裂解。 （2）破碎抽提核酸除去杂质： ①首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离； ②使核酸与蛋白质分离； ③除去脂类； ④多糖的除去。 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用氯仿/异戊醇抽提，可以得到微生物基因组DNA。 * 三、仪器和试剂 1、仪器： 低速离心机、高速冷冻离心机、恒温摇床、稳压电源、水平电泳槽、凝胶成像系统。 2、材料与试剂： 过夜培养的大肠杆菌DH5α、TE缓冲液、100g/LSDS、2mg/mL蛋白酶K、5mol/L NaCl、50g/LCTAB-0.5 mol/L NaCl、氯仿/异戊醇=24:1（V/V）、异丙醇、1×TAE、琼脂糖、上样缓冲液。 * 四、实验步骤 1、DNA的提取 （1）将10mL过夜培养的大肠杆菌DH5α装入15mL离心管中，4000r/min离心15min，弃上清。 （2）加入560μL TE缓冲液，将菌体重悬后转移至1.5mL离心管中。 （3）加入30μL 100g/LSDS溶液和30μL 2mg/mL蛋白酶K溶液，混匀后，37℃水浴放置30min。 （4）加入100μL 5mol/LNaCl溶液，充分混匀。 （5）加入80μL 50g/LCTAB-0.5mol/LNaCl溶液，混匀后，65℃水浴放置10min。 * 四、实验步骤 1、DNA的提取 （6）加入600μL 氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀后，12000r/min离心5min，将上清吸入新离心管中。 （7）加入预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，-20℃沉淀30min。 （8）12000r/min离心10min，弃上清。 （9）加入1mL 75%乙醇溶液，充分混匀。 （10）12000r/min离心10min，弃上清。 （11）加入20μL TE缓冲液，混匀后，即为DNA溶液。 * 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入20mL 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。 * 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （3）上样电泳：将20μLDNA样品溶液和5μL上样缓冲液混匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中10min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。