固相萃取与超高效液相色谱联用测定沼液中的四种植物激素.docVIP

固相萃取与UPLC联用测定沼液中的四种植物激素 文先红1 宋成芳2 张妙仙2 单胜道﹡ 2 1（浙江农林大学理学院，临安 311300） 2（浙江农林大学环境科技学院，临安 311300） 摘要：沼液中含有丰富的有机酸，植物激素等有机质，因而被广泛用作植物生长促进剂。本实验建立了一套可靠的在沼液中提取，纯化和测定四种重要的植物激素(GA3,IAA,ABA and ZT)的方法。经过液液萃取后，通过SPE固相萃取纯化和浓缩样品, 进入ACQUITY UPLC BEH C18 colum (2.1mm x 50mm ,1.7μm )进行色谱分离, 流动相采用甲醇和0.1%的甲酸水溶液（pH=3.2），流速0.22ml/min, 进行梯度洗脱，PDA检测。实验中对影响色谱分离的几种重要因素进行了讨论，样品中四种激素的回收率可达91.3% 到 101.2%，结果证明SPE-UPLC方法能对沼液中的四种激素进行高效率的分离，测定。 关键词： 沼液，激素，超高液相色谱，固相萃取 1 引言 沼液是沼气厌氧发酵后的产物, 含有丰富的氮、磷、钾等营养元素，还含有蛋白质，有机酸和多种植物激素，其速效营养能力强, 成分可利用率高, 而且具有防病抗逆作用, 是一种优质的具有生物肥料和生物农药双重功效液体肥料，特别其提取物可用作促进植物花果生长的叶面肥。植物激素中的细胞分裂素(ZT)能促进细胞分裂, 对种子和芽有促使萌发的作用, 含有的3-吲哚乙酸(IAA)能促进种子发芽, 提高发芽率，赤霉素(GA)可以刺激农作物茎、叶快速生长, 而脱落酸抑制生长、促进衰老的作用Sep - Pak C18 （500 mg, 3 mL, Waters公司），标样ZT ，GA ，IAA，ABA为 SIGMA 公司产品; 甲醇、三乙胺BEH C18 柱（2.1mm x 50mm ，1.7μm）; 流动相为A为甲酸水溶液（w/v,0.1%, 甲酸先用三乙胺TEA）调节pH=3.2.）, B为甲醇, 流速0.22ml/min。流动相梯度设置: 0～3 min, 90% A; 3～6 min, 90～70% A; 6～10 min, 70% A; 10～16 min, 70% ～55% A; 16～18min, 55% A;18～18.1min, 5% A; 18.1～20.1 min, 5% A; 20.2min, 90% A。检测: DAD，200-450nm 。进样量: 10 μL; 柱温: 25 ℃。 2.3 样品前处理 从沼液池中取出的液体过滤浓缩20倍得到沼液50ml, 加入50 mL 80% 冷甲醇，4 ℃冷浸提取24 h ; 于4 ℃5 000 r/ min 离心10 min , 重复3 次, 残渣用少许80 %甲醇洗3 次, 合并全部洗涤液和浸提液, 用等体积石油醚萃取脱色3次, 其水相用1 mol/ L 盐酸调pH至2. 5 , 用等体积乙酸乙酯萃取3 次, 弃去水相; 合并乙酸乙酯相在于35～40 ℃下减压蒸发至10ml后， 用真空干燥箱干燥, 再用10ml 10%的甲醇溶解，再过Sep - Pak C18小柱（放入样品前，先用5ml的methano净化，再用5ml去离子水活化, 放入试液后, 用去离子水5ml先淋洗，再用5ml 80%的甲醇洗脱） 收集后, 再经超滤膜过滤, 作为供试液。 3. 结果与讨论 3.1 pH对沼液中激素提取效果的影响 由于植物内源激素本身是偏酸性的物质，为了得到最大乙酸乙酯萃取效率，实验了不同的酸性pH=2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5对萃取的影响，实验过程中萃取时间为30min，室温250c遮光进行以防止吲哚乙酸的分解。结果显示酸性越强萃取效果越好，故实验中用盐酸把pH调节到2.5进行萃取。 3.2 色谱条件的优化选择 实验采用甲醇和甲酸水溶液作为流动相，由于这几种植物内源激素偏弱酸性，重点考察了pH的变化对分离效果的影响。当pH在3.2, 3.4, 3.8, 4.2, 4.6 之间变化时，发现pH高于3.2时随着pH 的增大组分的保留时间变长，且峰形变钝有拖尾现象，在酸性较高时峰形有明显改善，减少了拖尾程度，可能由于抑制了其它杂质离子与组分之间的竞争平衡及一些不可逆化学吸附从而使峰的形状得到了改善，最后采用pH 为3.2。 相对于固定洗脱，采用梯度洗脱法能延缓出峰时间以避开部分杂质峰干扰, 从而达到较好的分离效果，特别是其中赤霉素GA与吲哚乙酸IAA组分的保留特性相似，容易发生峰的干扰，采用上述梯度洗脱程序可在15min之内将这些组分完全分离，不仅可以大大加快分析速度而且峰形也好，定量