基因组研究进展作业.docxVIP

通过转录组测序我们得到了某木本植物A的一条EST（ExpressedSequenceTag）序列（核基因组），同时发现这个EST序列的表达量在干旱胁迫下明显升高，且本植物A目前没有可参考的基因组序列，但它的同源性与毛果杨(Populustrichocarpa)很高。论述：（2000-3000字，可以加相关的图示说明）1.你如何判断这个EST序列是否是一个完整的ORF(OpenReadingFrame)。如果不完整，我们可以通过什么样的方法得到它完整的ORF，并简要说明原理？2.通过实验1.得到这个EST序列的完整ORF后，我们如何来初步预测它的生物学功能？3.我们可以通过哪些实验方法对这个ORF所编码的蛋白质进行功能研究，并请说明设计这些实验的目的和必要性，以及原理。EST简介EST(Expressed Sequence Tag，表达序列标签)是指通过对 cDNA 文库随机挑取的克隆进行大规模一步法测序所获得的 cDNA 的 5或 3端序列，长度一般为 300～500bp，EST是基因的“窗口”，可代表生物体组织某一时空的表达基因，故称之为“表达序列标签”。EST概念提出后，被广泛应用于基因克隆、功能分析等方面，直接推动了人类基因组计划提前完成；EST 技术也是基因芯片技术的基础，将在执行 EST 计划中所获得的序列点制成芯片，成为了研究基因功能的强大平台。ORF完整性的判断ORF（开放阅读框）是起始密码子和终止密码子之间的碱基序列，是潜在的蛋白质编码区。判断ORF完整性可以采用Kozak 规则预测以及软件预测两种方法。ORF的一般规律：a. ORF通常不会出现在重复片段区域b. 随机出现较长ORF的概率很小，因此，当ORF较长时可信度较高c. 根据是否存在Kozak序列(ACCACCAUGG)判断起始位点d.寻找起始密码子上游是否存在核糖体结合位点(起始密码子上游约8~13核苷酸处，AGGAGG)e. 密码子出现频率应符合特定物种的密码子偏爱性f. G/C出现频率较高Kozak 规则预测ORF通常以 ATG 开始，TAA、TGA、TAG 结束。通过寻找起始密码子和终止密码子的ORF 序列是寻找基因的一种重要的方法；寻找 ORF 的成功的关键在于终止子在 DNA 序列中出现的频率。A 起始密码子 ATG。第一个 ATG 的确定(依据 Kozak 规则)。Kozak 规则：若将第一个 ATG 中的碱基 A，T，G 分别标为 1, 2 , 3位，侧翼碱基序列具有以下特征：1）第 4 位的偏好碱基为 G；2）ATG 的 5’ 端约 15bp 范围的侧翼序列内不含碱基 T；3）在 -3，-6 和 -9 位置，G 是偏好碱基；4）除 -3，-6 和 -9 位，在整个侧翼序列区，C 是偏好碱基。由于多数基因 ORF 均多于 50 个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF 不少于 100 个密码子。软件预测每个编码蛋白的基因都含有 ORF，它是由一系列密码子组成，通常以 ATG 开始，TAA、TGA、TAG 结束。通过寻找起始密码子和终止密码子的ORF 序列是寻找基因的一种重要的方法。使用Sequencer、ORFinder、DNAMAN、GeneSplicer、NetGene2 等预测分析该ORF上游在起始密码ATG之前是否有序列的终止子，是否有类似启动子或增加子的序列，如果是真核，下游UTR区是否有加尾信号，是否有PolyA尾，在起始密码子之前有个kozak序列，在终止密码子之后有AATAA 和polyA，基本就确定是完整的了。1.33’ 端的确认3’ 端的确认主要根据 Poly(A) 尾序列，若测试DNA 片段不含 Poly(A) 序列，则根据加尾信号序列 “AATAAA” 和 BLAST 同源性比较结果共同判断。5’ 端的确认通过同源性比较来预测 mRNA 的 5’ 端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/)；另外个别生物基因组的特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有 CpG 岛。完整的ORF的获得根据以上的结果预测出的ORF如果不完整，理论上可以采用以下三种方法：①cDNA 文库构建；②RACE 技术；③通过对全长cDNA 序列的测序、对比，以及与基因组DNA 的比较，确定基因所在的区域；通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置。但其目前没有可参考的基因组序列，所以使用BLAST与毛果杨进行同源性对比分析（在进行 EST 分析时，同时使用 B1astN 和 B1astX会得到较准确的结果），通过与储存在序列数据库中的毛果杨序列相