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在一株极端嗜热古菌中CRISPR调节的病毒抵御体内活性 摘要 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) 成簇的规律间隔的短回文重复序列 SSV1病毒的重组变异型所包含的接合质粒pNOB8的一个基因标志染色体上相应CRISPR间隔区的靶子，这个重组变异体在转染实验中被测试。当染色体CRISPR间隔区完美的与前间区序列匹配，几乎100%的对病毒的免疫抵抗被发现。CRISPR/Cas靶定是不依赖靶基因的转录的。本实验第一次阐明在古菌中CRISPR/Cas的体内活性并暗示DNA在古菌中作为靶子。 介绍 2002：古菌和细菌全基因组序列分析导致CRISPR的发现。 2009,2010：重复序列和它们介入的短间隔区序列的潜在功能以及连接作为免疫防御组分的Cas蛋白的功能被发现。 2007：该系统的体内活性在嗜热链球菌中阐明。 2008：经Cas蛋白家族的CRISPR调节干扰在表皮葡萄球菌中以DNA而非RNA为靶。 2010：嗜热链球菌侵入的双链DNA快速裂解在体内阐明。 2008：以大肠杆菌和噬菌体λ研究，阐明Cas蛋白裂解重复序列中CRISPR RNA前体的活性是成熟CRISPR RNA干扰病毒DNA的先决条件。 CRISPR Cas loci在绝大多数古菌基因组中被发现，而在细菌中只有一半已测序的细菌基因组中有发现——CRISPR loci在古菌中比细菌中大且多。 在Pyrococcus furiosus这种极端嗜热古菌中，体内的靶RNA位点特异性裂解是依赖于和CRISPR衍生的小RNA的互补以及Cas RAMP 模块（Cmr） 蛋白。 为了探究CRISPR/Cas调节在古菌内的活性发展了一种对极端嗜热菌泉门古菌硫矿硫化叶菌S. solfataricus及它的病毒SSV1的体内系统。该病毒是非溶菌的且在细胞内像质粒那样复制自己的15Kb大小的环状DNA，但也位点特异性的整合到宿主染色体上。S. solfataricus最适生长温度为80℃，PH 3，转染/感染和噬噬菌斑试验在这个病毒宿主系统已得到优化。此外为了研究体内基因表达，一个以SSV1病毒为基础的穿梭载体完成建立。S. solfataricus P2含有复杂的CRISPR/Cas基因座的阵列，包括6个不同的CRISPR重复阵列和不同套数（sets）（或多或少）的结合cas 基因（图一）。其中一套定位于接近CRISPR基因座3和4的cas基因已划入Sulfolobus CRISPR family II。CRISPR重复区域分别有102 和 94 个间隔区。这两套CRISPR与其关系密切的S. solfataricus P1是不同的，体现在间隔区的数量和性质尤其是位于朝向前导序列的末端。P1中的CR3和CR4分别只有52个和35个与P2相同的间隔区。这些不同表明基因座活跃的被新的间隔区的获得修饰，这些新的间隔区优先与邻近细菌前导序列的位点合并。 此处我们阐明CRISPR调节的在S. solfataricus P2内抵抗重组SSV1病毒，基于P1没有的CR3-4CRISPR间隔区。展示CRISPR模块由染色体外因子携带，当它包含靶向染色体中的非必需基因的间隔区时，是不被宿主细胞接纳的，但包含无关序列是被接纳的。我们的结果指出CRISPR/Cas涉及攻击在S. solfataricus中的入侵DNA的防御机制。 Fig. 1. Different CRISPR/Cas loci in S. solfataricus P2. Different colours report different categories分类 of CRISPR-associated proteins (Cas). purple: ‘core’ cas genes (numbers representing cas1 through cas6) pink: Apern subtype亚型 (csa1 through csa5a and csaX) green: cas genes with high similarity to Mtube subtype (csm1 -- csm3) orange: Cmr Module (cmr1 through cmr6) blue: proteins annotated as CRISPR-related proteins but with no or low similarity to other proteins with known function in the databases grey: IS elements and putative假定 transpo