植酸酶活性的测定--钼蓝法.docVIP

植酸酶活性的测定——钼蓝法 1 原理 针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。 植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3?MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。 酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷定义为1个酶活力单位（U） 2 试剂 本规定中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。 清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。 2.1 乙酸缓冲液A（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入0.5gTriton X-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。 2.2乙酸缓冲液B（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。 2.3 植酸钠溶液（6.25mmol/L）：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L）。 2.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。 2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。 2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。 2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。 2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。 3 仪器设备 恒温水浴锅，分光光度计（有10mm比色皿），磁力搅拌器，涡流式混合器，酸度计（精确至小数点后两位），离心机（最高转速4,000rpm以上），其它实验室常用设备。 4 标准曲线绘制 将4.0mmol/L磷酸二氢钾标准溶液用乙酸缓冲液（2.2）稀释成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，按表1的操作步骤一起反应。以无机磷含量为纵坐标（0.2ml以上稀释液无机磷含量分别为：0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μmol），以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程（Y=KX+B）。 5 样品测定 5.1 试样溶液的制备 建议称取5-10g含酶饲料，精确至0.01g，置于100mL容量瓶中，加入乙酸缓冲液（2.1）定容（之前需充分搅拌20min），取其中2-10ml置于另一100ml容量瓶中用乙酸缓冲液（2.2）定容。稀释的最终结果应使样液浓度保持在0.02-0.06U/mL.左右，待反应。 5.2 反应 按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物（2.3）开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃保温30min。 反应步骤及试剂、溶液用量见表A1。 表1 反应顺序 样品，标准 样品空白 标准空白 样品稀释液（ml） 0.2 0.2 — 乙酸缓冲液 (2.2)（ml） — — 0.2 37℃预热5min √ √ √ 依次加入底物（2.3）（ml） 0.8 0.8（第二步） 0.8（第二步） 混合 √ √ √ 37℃保温30min √ ― ― 依次加入终止液（2.4）（ml） 1.0 1.0（第一步） 1.0（第一步） 依次加入显色剂（2.7）（ml） 1.0 1.0 1.0 混合 √ √ √ 总体积（ml） 3.0 3.0 3.0 A5.3 样品测定 反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计700nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A－A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品植酸酶的活性。 A6 结果计算和表示 植酸酶活性U按下式计算： K× K×（A－A0）×V S×m×30 U = ×F 其中：U——样品植酸酶活性，U/g； K——标准曲线斜率； F——样品溶液反应前的总稀释倍数； S——样品测试量，表1中S＝0.2ml； V——反应总体积，表1中V=1ml