HCV及HIV实验室诊断.pptVIP

丙型肝炎病毒抗体检测 原理： 本品系用纯化基因工程丙型肝炎病毒（HCV）抗原和人工合成肽抗原相配比包被的微孔板和酶标记特异性抗人IgG，配以缓冲液和其它试剂组成。应用间接法原理（ELISA）检测人血清或血浆中的HCV抗体。 丙肝抗体操作步骤 以丽株试剂为例 1. 加样：将预包被板条固定于板架上。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔，分别加入阴、阳性对照100ul；设空白对照1孔，只加样品稀释液100 ul。其余孔加入100 ul样品稀释液，再加入10ul待测样品。2. 温育：振荡混匀，置37℃温育30分钟。3. 洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30－60秒，弃去孔内洗液，扣干。重复洗6次。 4. 加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入酶标记物100ul。5. 温育：置37℃温育20分钟。6. 洗涤：弃去孔内酶标记物，重复洗6次（同操作步骤3）。  7. 显色：每孔加入底物缓冲液50ul（1滴），再加入底物液50ul（1滴），振荡混匀，置37℃温育10分钟。8. 终止：每孔加入终止液50ul（1滴），轻拍混匀。在单波长450nm或双波长450nm/630nm下，用空白孔校零，再读取各孔OD值。结果判读1. 要求： 阳性对照OD值应 ≥ 0.50????????? 阴性对照OD值应 ≤ 0.12（空白校零后）2. 临界值（C.O.）计算： 临界值（C.O.）= 0.12 + 阴性对照平均OD值??? 备注：阴性对照平均OD值小于0.05按0.05计算，大于0.05按实际值计算。3. 结果判定：样品OD值 ≥ 临界值（C.O.）为HCV抗体阳性样品OD值 ＜ 临界值（C.O.）为HCV抗体阴性 注意事项 1. 从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可使用。2. 未使用的预包被板条应置于封口袋，2～8℃保存。3. 若20倍浓缩洗液出现结晶，请放置37℃至溶解。4. 滴加试剂时，应先摇匀，并弃去1～2滴后，垂直滴加。5. 洗涤时各孔均需加满洗液，防止孔口有游离酶不能洗净。6. 结果判读请在15分钟内完成。7. 不同批号的试剂组份不可混用。 HIV抗体的检测 策略 检测HIV抗体是常规使用的HIV病原学诊断方法。为了使检测结果达到尽可能高的准确性， HIV检测使用特殊的策略. 即：高敏感的方法进行初筛，初筛阳性的标本再用特异性强的方法进行确认，也称“金标准”方法。 诊断的金标准：HIV特异性抗体检测 EIA（高敏感性）+WB（高特异性）诊断的准 准确率大于99%，假阳性率约为0.0006%，造成错 误诊断的机会几乎是0。 同时，为了减少检测的错误和误差，还要采取严格的质量保证、质量控制评价措施 ELISA方法原理 第三代（双抗原夹心法） 该方法的原理是将HIV抗原包被在96孔板底部，加入待检血清与之反应，洗涤后加酶标记抗人IgG。洗出多余的酶后，再加底物显色。若血清中含有HIV抗体，被固定住的酶使底物反应颜色变深，经测定得到很高的光密度值，为阳性反应；反之为阴性。 该方法通常是被用作HIV抗体检测的初筛试验，测定阳性结果需做重复试验，重复阳性结果仍需经确证实验证实才能肯定。 操作步骤 1. 加样：将预包被板条固定于板架上。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔，分别加入阴、阳性对照50ul；设空白对照1孔，不加样品。其余孔加入待测样品50ul。2. 温育：置37℃温育30分钟。3. 洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30－60秒，弃去孔内洗液，扣干。重复洗6次。4. 加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入酶标记物50ul。5. 温育：置37℃温育30分钟。6. 洗涤：弃去孔内酶标记物，重复洗6次（同操作步骤3）。 7. 显色：每孔加入底物缓冲液50ul，再加入底物液50ul，振荡混匀，置37℃温育30分钟。8. 终止：每孔加入终止液50ul，轻拍混匀。在单波长450nm或双波长450nm/630nm下，用空白孔校零，再读取各孔OD值。 结果判读 1. 要求： 阳性对照OD值应 ≥ 0.80????????? 阴性对照OD值应 ≤ 0.12（空白校零后）2. 临界值（C.O.）计算： 临界值（C.O.）= 0.15 + 阴性对照平均OD值??? 备注：阴性对照平均OD值小于0.08按0.08计算，大于0.08按实际值计算。3. 结果判定：样品OD值 ≥ 临界值（C.O.）为HIV抗体阳性样品OD值 ＜ 临界值（C.O.）为HIV抗体阴性初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试，按照《全国艾滋病检测工作规范》需将血样或重新采血送“HIV 确认实验室”进行确认试验。确认报告阴性者，血可发放使用；凡确认实验阳性或