蛋白质配基相互作用鉴的定.docVIP

10. 蛋白质－配基相互作用的鉴定 Timothy Palzkill 张晓君、毛跃建、李旻、张晶、赵琴丽、徐灵筠译；申剑初校；张晓君修校 10.1 前言 基因组测序计划已鉴定了大量的以前未知的基因。然而，甚至对于已被深入研究的模式生物，如大肠杆菌和酿酒酵母，大约三分之一的基因的功能仍未知。了解基因组中所有基因的功能的挑战促进了高通量实验技术的发展，并因此推动了大规模描绘蛋白质－蛋白质以及蛋白质－配基的相互作用。 蛋白质－蛋白质相互作用在功能性细胞内扮演着重要的角色。在基因组规模上确定蛋白质的相互作用可建立蛋白质相互作用网络，这种网络可为基因产物的功能提供重要的线索。例如，如果一个未知功能的蛋白可与已知功能的一族蛋白相互作用，说明这个蛋白与它们具有相同的功能（Schwikowski等，2000）。蛋白质－蛋白质相互作用的鉴定可以通过提供它们与复合体的结合模式为生物学过程的机制的了解提供新观点。例如，即使知道一类蛋白参与某个生物学过程，我们也不知道这些蛋白是否或怎样与复合体相互作用以实现它们的功能。蛋白质－蛋白质作用谱图提供了蛋白质相互作用的详细信息因此提供复合体组织的精确信息。 本章综述了在基因组规模上蛋白质相互作用的研究方法。包括如酵母双杂交系统的在体方法和一些体外方法，如质谱、噬菌体展示和蛋白芯片等。 10.2 开放阅读框的高通量克隆 测定基因组规模的蛋白功能的功能基因组研究依赖于开放阅读框的高效克隆。开放阅读框必须被克隆到可以大规模表达或便利地对编码蛋白进行功能性分析的质粒载体。由于所有蛋白不可能在一个系统中得到一样好的表达，对所感兴趣的基因应构建到多个蛋白表达系统。例如，用各种细菌的启动子测定可以确定哪个系统最适合表达。此外，对于功能分析，将感兴趣的基因插入载体用于噬菌体展示、双杂交分析或谷胱苷肽S转移酶（GST）融合。如果我们使用传统的采用限制性内切酶和DNA连接酶的克隆技术，构建这样一套载体所用的时间和费用将是不可想象的。但是，替代的新方法已可以便利地快速克隆PCR产物。 10.2.1 λ噬菌体att重组克隆 λ噬菌体位点专一重组系统已被用于创建有效的克隆系统。λ噬菌体具有裂解和溶源循环。在溶源循环，噬菌体不复制而将DNA整合到宿主的染色体上（Ptashne，1992）。一旦λ噬菌体感染后，溶源过程马上开始，λDNA环化、Int蛋白启动环状DNA整合入染色体。Int蛋白催化λ噬菌体结合位点（aatP）和E.coli结合位点(aatB)的位点专一的重组。一个称为整合宿主因子（IHF）的E.coli宿主蛋白对λDNA的整合也是必需的（Landy,1989）。整合反应具有高度的序列专一性，没有任何核苷酸的冗余与缺少。这个位点专一的重组并非同源重组，因为attB和attP有很大差异。这个位点有15个碱基对的核心序列5＇-　GCTTTTTTATACTAA。 由于同源的区域很小，在没有Int蛋白时重组无法进行。attB和attP 重组后的位点称为attL和attR（图10.1）λ噬菌体DNA 保持为前噬菌体状态直到宿主细胞被损坏（Ptashne，1992）。DNA损伤引发λint和xis基因的表达。Int和Xis表达产物催化细菌染色体上λDNA的剪切。在aatL和aatR位点的剪切产生aatB和aatP位点。剪切反应并非整合反应的简单的逆向反应，除了Int和IHF蛋白还需要Xis蛋白（Landy，1989）。所以，利用适当的重组蛋白可以控制重组反应的方向。 λ重组克隆系统方法就是将两端带有att重组位点的DNA和载体与整合蛋白一起保温使DNA片段插入载体（Hartley等，2000）。这个系统被称为重组克隆(RC)（Hartley等，2000）。此系统可被用于直接将PCR片段克隆到载体而无需DNA连接酶。插入PCR片段的反应是attB＋attPattL＋attR，与λ噬菌体插入相似也是被另加的Int和IHF蛋白催化。反应底物是带有attB位点的PCR片段和两端带有attP的选择性标记的质粒（图10.1）。与λ噬菌体插入不同的是，此反应用了两个attB 和两个attP，此外，att位点被突变使attB1只能与attP1而非attP2重组。att位点的改造使得PCR片段可以直接克隆到载体（图10.1）(Hartley等，2000)。 以RC法克隆PCR片段的最后结果是载体带有两端含attL位点的标记基因。此质粒被称为起始克隆(Entry clone)，因为它可以通过重组反应来产生各种功能载体（Hartley等，2000）。用于载体转换的反应是attL+attRattB+attP, 类似于λ噬菌体被Int、Xis和IHF蛋白剪切（Landy，1989）。通过对两种载体和Int、Xis及IHF蛋白的共同温育，起始克隆的基因被转到