第三章菌种选育的理论与技术试卷.pptVIP

* 第六节 原生质体融合技术 （一）原生质体融合技术简介 （二）原生质体融合技术的一般过程 （三）其它原生质体技术 * （一）原生质体融合技术简介 原生质体： 微生物或植物去除细胞壁后的结构。 原生质体的特性： 没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感脆弱。 原生质体融合： 通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。 * 原生质体融合技术的特点与实践意义 杂交频率高：霉菌、放线菌，10-3~10-4 ，酵母、细菌10-5~10-6 受接合型或致育性的限制较少：近亲，远亲均可进行； 遗传物质的传递更完整； 可以多株同时参与融合； 可以采用产量较高的菌株作融合亲株； 提高产量性状的潜力较大，可实现多基因重组； 有助于建立工业微生物的转化体系——原生原体转化。 * （二）原生质体融合技术的一般步骤 融合亲本的选择与标记； 原生质体的制备； 原生质体的融合； 原生质体的再生； 融合子的选择与鉴定； 目标菌株的筛选。 * 1. 亲本的选择与标记 亲本的选择： 具有优良性状； 具有一定遗传标记。 亲本标记： 营养缺陷型或抗药性等； 自然标记； 细胞质遗传标记：小菌落、Killer等； 生产性状本身。 * 2. 原生质体制备 1）原生质体制备是指以溶壁酶水解去除微生物细胞壁的过程。过程如下： 培养至对数后期； 预处理： 细菌，亚抑制量青霉素； 放线菌，1-4%Gly； 酵母，1%巯基乙醇和1%EDTA； 破壁：A、高渗溶液作渗透压稳定剂 B、破壁酶：细菌，放线菌：溶菌酶 霉菌：几丁质酶，纤维素酶 酵母：蜗牛酶或Zymolyase 浓度、温度、pH、时间，各不相同 注意问题：渗透压稳定剂（高渗保护）；考虑再生，脱壁不能太完全。 * 3. 原生质体融合 原生质体融合是指双亲原生质体混合在促融剂的作用下，细胞膜合二为一的过程。 促融剂：能够诱导原生质体融合的物质称为促融剂，按其性质分为三大类： 生物促融剂：病毒类物质； 化学促融剂： PEG（聚乙二醇)，Ca2+，Mg2+ 等，是使用最广泛的促融剂； 物理促融剂：电诱导融合 电融合： 原生质体在电场中极化成偶极子，沿电力线方向排列成串 加直流脉冲，原生质体膜被击穿，导致融合 * 影响融合率的因素； 原生质体制备与再生的条件； 促融剂的种类和浓度； 双亲组合及其原生质体的比例； 其它 * 4. 原生质体的再生 是指原生质体重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂的过程。 再生率10-3~10-1 再生培养基：加入渗透压稳定剂，不同微生物其再生培养基不同。 再生需要一定的细胞壁做引物。 影响再生的因素： 再生培养基及培养条件； 原生质体制备方法及条件 * 5.融合子的检出与鉴定 融合子的选择 ①利用遗传标记：营养缺陷型，抗性标记 ②利用灭活的原生质体 ③利用荧光染色 采用选择性培养基进行检出。 对是否是真正融合子进行鉴定：发生核融合后稳定，而不进行核融合形成的异核体不稳定。 6.目标重组子的筛选 * 7.原生质体融合技术的应用 （1）高产优良菌株的选育 例：亲株：乳糖发酵短杆菌 亲株1：产谷氨酸，DCr(德夸菌素)，KMr ( 酮基丙二酸)，发酵速度快； 亲株2：产赖氨酸，AECr，发酵速度慢 (100h) 融合子： DCr KMr AECr，发酵速度快(30h)，产赖氨酸提高3倍 （2）合成新的产物 * 三、其它原生质体技术（1） 原生质体诱变育种：以脱去细胞壁的原生质体作为处理对象的诱变育种方法。 优点：1）提高微生物对诱变剂的敏感性； 2）提高正变株的变异幅度，使诱变效果提高； 3）对于丝状微生物，原生质体可作为单个细胞 单位而便于控制，避免后代过多的分离现象。 缺点：1）诱变后原生质体再生较慢，因此较常规诱变 育种耗时长； 2）不适用于以青霉素淘汰野生型对营养缺陷型 突变体进行浓缩。 * 其它原生质体技术（2） 原生质体再生育种：通过菌体细胞脱壁后直接再生来改变菌株的遗传特性，提高产量或改良某些性状的育种方法。 特点：正变率较高。 原生质体转化