细胞损伤模型.docVIP

一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1　大鼠肝细胞的分离和培养　大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105　U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。2　CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16　mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。3　H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。4　检测指标（1）? AST、ALT的测定　培养的肝细胞经离心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性，结果以U·(106 cell)-1表示。（2）? 肝细胞增殖试验　采用MTT比色法。（3）? 肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性的测定　先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝细胞样品）0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm波长处读得吸光度（A）值。在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为：GSHpx活力单位=（［GSH］非酶管-［GSH］样品管-［GSH］试剂空白管）/3。结果以U·(106 cell)-1表示。（4 ） 肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定　先制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心（2 500 r·min-1，10 min），弃上清，加15％ TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以 nmol·(106 cell)-1表示。（5）? 数据处理　数据以±s表示，计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。二、体内肝损伤模型（酒精）1、材料　纯系SD雄性大鼠，体重180g～200 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。2、方法　将大鼠随机分成5组，饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水；根据大鼠体重，A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃 0、4周、8周和12周；E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。3、主要指标检测（1）肝功能：应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glb）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等。（2）氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化