实验二培养基的配制和灭菌.pptVIP

实验五 细菌的单染色和革兰氏染色 目 的 要 求 学习对细菌的涂片、染色和无菌操作技术。 了解染色原理、学习并掌握单染色和革兰氏染色技术 。 实 验 原 理 细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，染色后，菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物学中常用的是单染色法和革兰氏染色法。 实 验 材 料 菌种：E.coli （大肠杆菌） 、B.subtilis（枯草芽孢杆菌） 试剂：石炭酸复红染色液、革兰氏染色液(草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄/番红染色液） 其他：显微镜、载玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、吸水纸、擦镜纸等 1. 涂片-干燥- 固定 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-1.5分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒左右，后立即用流水冲洗 5. 复染：滴加番红染色液，染1-1.5分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。 1、用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2、打开光源，调节光亮度 3、低倍镜观察：粗调、细调 4、依次再进行中倍、高倍观察 5、油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6、换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。 结果与思考题 1你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2 涂片用的玻璃片为什么不得有油污？为什么涂片要求菌膜要均匀、薄？ 3 革兰氏染色的原理、依据是什么？ * * 单染色法：是用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红 等）使其着色。 当在中性、弱碱性、弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷。而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷， 因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。 G+：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 G—：细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 革兰氏染色法：是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 实 验 程 序 一、单染色法： 涂片→干燥固定→染色→水洗→干燥→镜检（高倍镜、油镜） 二、革兰氏染色： 涂片→干燥固定→结晶紫初染→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→水洗→沙黄复染→水洗→干燥镜检 1.先将载玻片洗净，擦干。 2.涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。 3.晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 4.固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5.染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。 6.水洗：用水洗去涂片上的染色液。 7.干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 8.镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 单染色法 革兰氏（Gram）染色法： 显微镜（