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一、目的要求 二、实验材料 三、实验原理 四、实验过程 五、实验任务 六、思考题 一、目的要求 掌握浇注平板法、涂布平板法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作 二、实验材料 1.菌种：大肠杆菌 2.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 3.试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿(直径90毫米) 、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅 三、实验原理 1. 平板划线法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。 2. 浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。 3. 涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地涂布在整个平板表面，经培养后，培养基表面会形成多个独立分布的单菌落。 浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。 浇注平板法较适合兼性厌氧的细菌和酵母菌的分离，涂布平板法则更适用于好氧性或有气生菌丝的放线菌和细菌的分离。 四、实验过程 1. 稀释菌悬液的制备 1. 称取土壤10 g，用研钵研碎放入90 mL无菌水的三角瓶中（加入玻璃珠），振荡10 min，即为稀释10－1的土壤悬液。 2. 另取装有 9 mL无菌水试管 5支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4。取已稀释成10－1的土壤液，振荡后静止0.5 min，用无菌吸管吸取1 mL土壤悬液加入10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－3、10－4 土壤稀释液。 2. 平板划线法 A. 每组取无菌培养皿2只，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。 B. 凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10-3或10-4）在平板上划线。 C. 划线完毕，盖上皿盖，倒置于37℃温室培养。 3. 浇注平板法 A. 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。先在无菌培养皿底部贴上标签，注明待分离菌名、稀释度、姓名、班级、分离方法等信息。 B. 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边； C. 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。 4. 涂布平板法 A. 每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 B. 取已熔化的培养基倒入培养皿制成平板。 C. 凝固后，另取一支吸管吸取10-3或10-4的稀释液0.2 mL放在平板上。 D. 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于37 ℃条件下培养。 五、实验任务 1、每人制2个牛肉膏蛋白胨培养基平板 2、每小组做一组菌悬液梯度稀释 3、每人通过上述三种方法（各一个皿）分离所给微生物 课后任务：实验结果的观察与记录（参照课本） 培养24 h以后，观察实验结果，清洗培养物 （周四下午2:00） 六、思考题 1、用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？ 2、要防止平板被划破应采取哪些措施？ 3、试比较浇注平板法和涂布平板法的优缺点和应用范围。 结 束 请注意实验台面清洁！ 请值日生留下来打扫卫生！ * * 微生物学实验 Lab work on Microbiology 三峡大学化学与生命科学学院微生物学教学组 实验指导老师：涂 璇 实验六、微生物分离纯化技术 图－1 土壤稀释液的制备和稀释液的取样