常用免疫组织化学染色方法.docVIP

常用免疫组织化学染色方法 ( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯 5分钟。2.切片经二甲苯 5分钟。3.无水酒精 30秒。4.无水酒精 30秒。5.95%酒精 30秒。6.95%酒精 30秒。7.90%酒精 30秒。8.80%酒精 30秒。9.70%酒精 30秒。10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。12.水洗。13.抗原修复。14.PBS洗3次，1分钟/次。15.加入血清孵育20分钟。16.摔干血清，加入一抗60分钟。 17.PBS洗3次，2分钟/次。18加入二抗孵育30分钟。19.PBS洗3次，2分钟/次。20.加入ABC复合物，孵育30分钟。21.PBS洗3次，2分钟/次。22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。23.PBS洗，水洗。24.Harris苏木素染核5-10分钟。25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。(二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS洗3次，1分钟/次。6.加入血清孵育10分钟。7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。9.PBS洗3次，每次2分钟。10.加入SP复合物孵育20-30分钟。11.PBS洗3次，每次2分钟。12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。13.PBS洗，水洗。14.Harris苏木素染核5-10分钟。15.水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。4.如果需要，可进行抗原修复。5.PBS洗3次，每次1分钟。6.加入正常血清真空负压处理5min。7.摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5分钟。8.PBS洗3次，每次2分钟。9.加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。10.PBS洗3次，每次2分钟。11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5分钟。12.PBS洗3次，每次2分钟。13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。14.PBS洗，水洗。15.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg)(四)Envision TM Systems.1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS洗3次，每次1分钟。6.加入一抗体孵育30-60分钟。7.PBS洗3次，每次2分钟。8.加入增强剂孵育20-30分钟。9.PBS洗3次，每次2分钟。10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育20-30分钟。11.PBS洗3次，每次2分钟。12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。13.PBS洗，水洗。14.Harris苏木素染核5-10分钟。15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。(五)免疫组化双染色法。() (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)1.切片脱蜡至水。2.0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。3.水洗。4.抗原修复。5.PBS洗3次，每次1分钟。6.加入非免疫性动物血清，孵育10分钟。7.PBS洗3次，每次2分钟。8.加入第一抗体孵育60分钟。9.PBS洗3次，每次2分钟。10.加入生物素化的第二抗体，孵育10分钟。11.PBS洗3次，每次2分钟。12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。13.PBS洗3次，每次2分钟。14.加入DAB-H2O2孵育5-10分钟。15.PBS洗3次，每次2分钟。16.加入双染增强液，孵育10分钟。17.加入非免疫性动物血清孵育10分钟。18.PBS洗3次，每次2分钟。19.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。20.PBS洗3次，每次2分钟。21.加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。22.PBS洗3次，每次2 分钟。23.加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。24.PBS洗3次，每次2分钟。25.加入AEC溶液，孵育5-10分钟。26.自来水洗。27.苏木素染核5-10分钟。28.水性封片。注：1.第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。(六)、免疫组化的双染色法() (Immuno-his