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常见绞股蓝属植物鉴别问题的生物技术应用解决方案 【摘要】：随着现代生物技术的迅速发展，利用分子标记方法解决绞股蓝属植物易混淆，以致难以鉴别的问题已成为可能。ISSR(inter-simple sequence repeat)标记技术是在SSR基础上发展起来的一项新的标记技术。即先用CTAB法提取绞股蓝属植物总DNA，以57条ISSR引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析，然后筛选出产物清晰稳定的14条引物，其中引物UBC-873与UBC-895具有较高的多态性条带比率，均可独立区分常见的几种绞股蓝属植物。因此，ISSR-PCR分析可有效区分鉴别常见绞股蓝属植物。 【关键词】：绞股蓝属；ISSR；区分鉴别 1 绞股蓝属植物基本情况 绞股蓝属Gynostemma BL.是葫芦科Cucurbitaceae的一个中小属[1]，植物为多年生攀援草本,包含16种2变种，隶属于2亚属2组，主要分布于热带亚洲至我国秦岭南坡、长江流域及以南广大地区和朝鲜及日本，生长在山地林中或山谷水沟旁，在石灰岩地带较为常见，其分布中心为我国西南地区。 该属广布种绞股蓝(G.Pentap hyllum(Thunb.)Makion)，被誉为“南方人参”，为我国常用中草药，具有悠久的应用历史。早在明代的《救荒本草》、《农政全书》，清代的《植物名实图考》以及近代的各类中草药著作中，均有记载。 现代药理学研究证明绞股蓝属植物含有与人参皂甙相似的成分，还含有多种维生素和黄酮甙，是一种具有人参作用，而无人参副作用的多功能保健药，被誉名为“世界四大保健品之冠”。具有抗肿瘤、抗疲劳、降血脂、益智健脑、提高免疫力、治疗白发症等多种功能，并且具有无毒、廉价等优点，广泛应用于医药保健领域。 2 绞股蓝属植物现存问题 绞股蓝属为热带亚洲分布类型，在我国秦岭长江以南地区广泛分布[1]，地理环境变化复杂，在其种系发生发展过程中，为适应新的环境形成了一系列的生态变异，属内各分类群之间形态特征交叉、过渡现象严重，鉴定困难。近几年来，由于生态环境的不断破坏，野生绞股蓝资源日益减少，而市场需求的不断增加，导致国内绞股蓝药材资源来源复杂，药材质量差异显著。 绞股蓝皂苷具有重要的生理活性，是评价绞股蓝品质的重要标志，绞股蓝属不同种间皂苷量差异显著，但由于其生长环境相似、植物形态学上难以区别，造成了市场上药材来源复杂，品质差异较大的情况[2]。目前采用的绞股蓝属植物分类系统，主要依据子房、果实形态进行划分[3]，由于属内种间形态特征交叉、过渡现象严重，为鉴定带来一定困难。因此，从形态学上难以区分，然而为有效利用绞股蓝属植物资源，对该属进行分类及正确鉴定显得尤为重要。 更多的研究表明，绞股蓝属内不同种之间在蛋白质营养成分[4]、皂苷量[5]、黄酮量[6]等方面均存在差异，同时种子微结构[7]、染色体数目[8]、过氧化物酶同工酶谱[9]也有不同，因此绞股蓝属分类问题的研究具有重要的理论与应用价值。随着现代生物技术的快速发展，分子标记技术应用在药用植物上大大提高了区分鉴别的效率，应用ISSR技术将成为解决常见绞股蓝属植物不能区分鉴别的难题的良好途径。 3 ISSR技术途径 近年来，随着分子标记技术的发展，中药鉴定逐步从形态组织学、化学水平提高到分子水平，各种DNA分子标记技术广泛应用于中药材的鉴定研究，DNA分子标记直接依据药材的遗传多样性特征，通过分析其特有的DNA片段对药材进行分类鉴别，具有准确快速、微量检测等特点。简单序列重复区间扩增多态(inter-simple sequence repeat, ISSR)是Zietkiewicz等在1994年创建的一种DNA分子标记技术，它利用重复锚定引物扩增出SSR之间的片断，具有重复性好、稳定性高、多态性丰富等优点，在种质鉴定、亲缘关系研究领域优势显著。 ISSR是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术，它是根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物，对两侧具有反向排列的SSR的一段DNA序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间ISSR标记的多态性。ISSR引物通常为16～l8个碱基，其主体是2-4个碱基组成的串联重复序列，然后在其5’端和3’端加上l～4个锚定碱基，从而保证ISSR引物能够对 SSR之间的DNA序列进行PCR扩增[10]。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而ISSR可以检测到高的多态性。另外，ISSR不像SSR具有物种特异性，它可以和RAPD一样用于各类动植物的研究。只是引物设计要求不同，但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息，而且比RAPD技术更加稳定可靠，实验重复性更好。 因此，针对我国常见的7种绞股蓝属植物：绞股