动物细胞与组织培养-干细胞.pptVIP

华侨大学 生物工程系 刘建福 第4章动物细胞与组织培养－－干细胞 干细胞的有关特性 一、形态和生化特征 形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例较大 干细胞具有较高的端粒酶活性，具有较强的增殖能力 二、增殖 缓慢性－－利于细胞对特定的外界信号作出反应，以决定进行增殖还是进入特定的分化程序。还可减少基因发生突变的可能性。 自稳性－－干细胞自我更新维持自身数目的恒定。这是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。 干细胞 干细胞的分裂 正常干细胞发育 胚胎干细胞 胚胎干细胞包括ES细胞（embryonic stem cell）和EG细胞（embryonic germ cell）。 ES细胞：当受精卵分裂发育至囊胚期，胚胎细胞在囊胚腔内成团存在，称为内细胞团（inner cell mass）。将细胞团的细胞分离出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性。 EG细胞是由原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）培养分离得到。 ES是一种高度分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 ES细胞可以在体外培养成为永久性细胞系，人们可以在体外对其进行各种遗传操作，通过核移植技术生产转基因动物。 胚胎干细胞 1998年他们在建立灵长类胚胎干细胞取得成功的经验基础上，从接受不孕症治疗的夫妇所捐赠的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出人的ES细胞。同年，Gearhart从选择性流产所得到的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞。 2000年，澳大利亚的Reubinoff和新加坡的体外受精专家合作，又成功地从人胚泡中建立了8株未分化的人胚胎干细胞，并在体外分化实验中成功地得到了神经干细胞。 胚胎干细胞的生物学特性（P142－143） 1 ES细胞形态结构与核型 2 ES细胞的生长特性 3 ES细胞的高度分化潜能 ES细胞的全能性表现： 1 形成畸胚瘤，将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胚瘤，包括三个胚层细胞。 2 形成类胚体，将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，能够生成类胚体，是一个与畸胚瘤相似的多种系混杂的集合体，具有三个胚层组织。 3 直系分化，通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达， ES细胞可直接分化成某特定种系细胞。如NeuroD2和NeuroD3转入ES细胞可分化为神经细胞。 4 形成嵌合体，将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体。 ES细胞的调控 ES细胞的调控是指给出适当的因子条件，对ES细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 一 内源性调控 1 细胞内蛋白对ES细胞分裂的调控 ES细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称性是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分，对细胞的发育非常重要。 2 转录因子的调控 脊椎动物中转录因子对干细胞分化的调节非常重要。胚胎干细胞的发生中，转录因子OCT4是必需的。 OCT4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同属间的转录调控是不完全一致的。 二、外源性调控 1 分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖、分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，即TGFβ家族和Wnt信号通路，如TGF家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。Wnt的作用机制是通过阻止β-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录，促进干细胞的分化。 2 膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞－细胞的直接接触起作用的。 β-Catenin就是一种介导细胞黏附连接的结构成分。穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响。 3 整合素与细胞外基质 整合素家族是介导干细胞与细胞外基质黏附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。如β1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。 ES细胞的鉴定 1 形态学检测 体外培养的ES细胞细胞形态为圆形或扁圆形，均呈单层或多层密集堆积而形成岛状、巢状群体生长状态。 2 碱性磷酸酶（AKP）活性的检测 碱性磷酸酶在早期胚胎的干细胞中含量较高，而在已分化的细胞中活性明显降低。 ES细胞表面可以检测到特异性表面抗原（SSEA-1）, SSEA-1 常作为ES细胞鉴定的一个标志。 体内分化实验 将ES细胞悬液化注射给同种动物皮下，制作切片染色可观察到畸胎瘤