western blot protocol 最终版.docxVIP

Western blot实验方案【实验目的】了解western blot原理，掌握有关的操作方法。【实验原理】Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。【实验仪器、材料和试剂】（1）仪器、用具：高速冷冻离心机、振荡器、-80℃冰箱、-20℃冰箱、酶标仪、水浴锅、涡旋器、SDS电泳仪、PH自动控制加液机、摇床、半干转膜仪、湿转膜仪、凝胶成像系统、托盘、量筒、1L烧杯、小烧杯、冰盒、孵育盒、纤维垫、玻璃棒、有齿镊子、无齿镊子、表面皿、搪瓷盘、移液器、细胞刮刀、计时器（2）耗材：15mL离心管、50mL离心管、1.5mL EP管、96孔板、普通滤纸、whatman 3mm滤纸、PVDF膜、一次性枪头、棉球、保鲜膜（3）材料：人乳腺癌MCF-7细胞株、人乳腺癌MDA-MB-231细胞株（4）试剂：75%酒精、0.25%胰蛋白酶、PBS、RIPA裂解液、PMSF、bradford蛋白定量检测试剂盒、1.0mol/L Tris?HCl (pH6.8)、1.5mol/L Tris?HCl(pH8.8)、10%AP、TEMED原液、30%丙烯酰胺(29：1)、10%SDS阴离子去污剂、Sample Loading Buffer (5X)、BSA牛血清白蛋白、Running Buffer(5X)、transfer buffer、无水甲醇溶液、脱脂奶粉、10XTBS缓冲液、Tween-20、β-actin、一抗、带HRP二抗、DAB显色试剂盒、Stripping Buffer膜再生利用液（5）需要配制：分离胶、浓缩胶、封闭液（抗体稀释液）、洗脱液需要稀释：加样缓冲液、电泳缓冲液 、转膜液 其余按照说明书操作。 ★分离胶：6%8%10%12%15%双蒸水5.4mL4.7mL4.1mL3.4mL2.4mL30%丙烯酸胺2.0mL2.7mL3.3mL4.0mL5.0mLTris-HCl(1.5M pH8.8)2.5mL2.5mL2.5mL2.5mL2.5mL10%SDS100μL100μL100μL100μL100μL10%AP50μL50μL50μL50μL50μLTEMED5μL5μL5μL5μL5μL总体积10mL10mL10mL10mL10mL每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。配多少按比例添加。丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围20%4-40 kDa15%12-45kDa12.5%10-70 kDa10%15-100 kDa7.5%30-120 kDa5%60-212 kDa★5%浓缩胶（两块胶，6mL）：双蒸水4.1mL30%丙烯酰胺1mLTris-HCl（1M， pH6.8）0.75mL10%SDS60μL10%AP60μLTEMED6μL每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。配多少按比例添加。★封闭液/二抗体稀释液（5%脱脂牛奶/5%BSA)（现用现配）： 1XTBST缓冲液95-100 mL脱脂奶粉/BSA5g溶解后4℃保存，用微孔滤膜过滤，可于一周内使用。★3%BSA in TBST（一抗稀释液）：BSA牛血清白蛋白15g1X TBST缓冲液450mLHCl(FW 36.46)盐酸调整PH 7.4（可以不用调）1X TBST缓冲液定容至500mL，含BSA终浓度3%（w/v）-20℃分装储存★1XTBST缓冲液（洗脱液）：10XTBS缓冲液100mL蒸馏水900mLTween-201 mL因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，可防止产生气泡。溶解后室温保存。Tween-20取0.5mL专用于配制封闭液和抗体稀释液。★稀释Western Transfer Buffer （转膜液）10X→1X：10X电泳转移缓冲液（转膜液）100mL无水甲醇200 mL加入蒸馏水或去离子水，定容至1L，混匀后即可使用，新配制的1×电泳转移缓冲液工作液室温可保存两周左右。★稀释Sample Loading Buffer (5X)→(1X):加双蒸水稀释5倍,比如取100mL上样缓冲液 (5X)+400mL双蒸水,配制成500mL上样缓冲液(1X)