第三节1多肽和蛋白质类药物的生产.pptVIP

第三节 多肽及蛋白质类药物 提取法生产胸腺素 提取法生产胰岛素 提取法生产胸腺素 1966年Goldstein等首次报道从小牛胸腺中提取了部分纯化的胸腺素，1972年进一步纯化分离得到一组具有免疫活性的多肽，称胸腺素F5（即从小牛胸腺提取得到的第5种组分），并可提供临床使用。 药理作用与临床作用 促进T淋巴细胞分化成熟。 （1）临床上主要用于治疗细胞免疫缺陷疾病，如胸腺发育不良、重症联合性免疫缺陷症、多次感染综合症等； （2）肿瘤化疗和放疗并用胸腺素可使细胞免疫应答增强，从而加强化疗和放疗的抗肿瘤效果。 胸腺素 具有增强细胞免疫功能和调节免疫平衡等作用。用于治疗细胞免疫缺损性疾病，如胸腺发育不全、重症混合性免疫缺乏症、运动失调性毛细血管扩张症、麻风、重症感染、复发性口疮等伴有细胞免疫功能低下的患者。亦可用于病毒性肝炎、恶性肿瘤和抗衰老。 提取法生产胸腺素 胸腺素的结构与性质 胸腺素是几十种多肽组成的混合物，相对分子量在1万以下； 等电点在3.5～9.5；为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较，根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名，共分三个区域： α区：3.5～5.0 三个区域 β区：5.0～7.0 γ区：7.0～9.5 胸腺素对热稳定，短时间内加热至80℃，其生物活性不降低。 提取法生产胸腺素——提取工艺路线 提取法生产胸腺素——工艺说明 工艺过程 a．预处理：去脂肪，绞碎 b．提取：生理盐水（盐水溶液），匀浆，离心（组分1） c．除杂蛋白：加热，60℃，离心（组分2） d．纯化： 分段盐析 pH=7.0磷酸盐缓冲液，硫酸铵饱和度0.25，上清液（组分3） 调pH=4.0，硫酸铵饱和度0.5，盐析物（组分4） 除杂 0.1M Tris-HCl缓冲液（pH=8.4）溶解，4000×离心30min 色谱分离 凝胶层析Sephadex G-150柱，第3个峰（葡聚糖凝胶，分离范围5,000～300,000） 脱盐 凝胶层析Sephadex G-25柱，第1个峰（分离范围1000～5000） e．干燥：冷冻干燥（组分5） 提取法生产胸腺素——工艺说明 工艺讨论 （1）除加热步骤外，所有步骤应在0～4℃下进行。 （2）组分4过Sephadex G-150柱时，在276nm波长检测共有4个吸收峰，胸腺素活性位于第3个峰。进一步Sephadex G-25柱脱盐，共有2个吸收峰，胸腺素活性位于第1个峰。 提取法生产胰岛素 1、功能和来源 （1）功能 　　调节血糖浓度，治疗胰岛素依赖性糖尿病。 　　1965年，我国完成了世界上第一个人工合成蛋白质——牛结晶胰岛素的全合成工作。 （2）来源 　　胰脏中胰岛β细胞（胰岛中包括α细胞、β细胞、γ细胞）分泌的一种蛋白质激素。 1965年9月17日，我国在世界上第一次人工合成了一种具有生物活性的结晶蛋白质——胰岛素，从而表明我国在多肽和蛋白质合成方面的科学技术已在世界上居先进地位。这种胰岛素是经过几年的艰苦努力，由中科院生化所、有机化学所和北大化学系合作，在王应睐和汪猷领导下合成成功的。 提取法生产胰岛素 2、结构与性质 （1）结构 　　由A链、B链通过2个二硫键连接而成。 （2）性质 　　①白色或类白色结晶粉末。 　　②相对分子量：牛5733，猪5764，人5784。 　　③胰岛素在pH=4.5～6.5范围内几乎不溶于水。 　　④在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。 提取法生产胰岛素 提取法生产胰岛素 工艺过程 　　方法：酸醇法和锌沉淀法 　　（1）提取：酸醇法 　　（2）碱化、酸化：除碱性蛋白、酸性蛋白 　　（3）浓缩：30℃以下，减压浓缩 　　（4）去脂、盐析：去除脂类、分开杂蛋白 　　（5）酸化、锌沉淀：除酸性蛋白 　　（6）碱化、锌沉淀：除碱性蛋白 　　（7）洗涤、干燥：胰岛素成品 ■ 质量鉴定——多肽和蛋白质含量测定 　1、凯氏定氮法（GB/T5009.5-2003） 　　 蛋白质是含氮的有机化合物，与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数（6.25），即为蛋白质含量。 　2、紫外分光光度法 　　 即利用蛋白质在280nm处的的吸收峰，以标准蛋白质为参考，检测其中的蛋白质含量。 质量鉴定——多肽和蛋白质含量测定 　　3、福林-酚试剂法（Lowry法） 　　蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸,能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质