微生物限度检查方法的验证.docVIP

目的（PURPOSE） 规范微生物限度检查方法验证，确保微生物限度检验方法的结果准确可靠 适用范围（SCOPE） 微生物限度检查方法验证的起草实施及报告 职责（RESPONSIBILITY） 微生物实验室对本程序的执行负责 关键词（KEY WORDS） 微生物限度检查方法验证 定义（DEFINITION） 不同的检品、不同的检测仪器、试液和培养基及实验环境条件等均可能对检验结果产生影响。在检验实践中，主要是以下几种因素对微生物检查产生影响： 药品本身的抑菌性 药品中防腐剂的抑菌性 培养基的促菌生长能力 培养条件 过滤系统的材质 为了使微生物限度检查方法的结果准确可靠，需要对每个品种的具体限度检查方法进行验证。微生物限度检查方法准确与否的核心是对药品抑菌性的有效消除。常见方法有化学中和法、稀释法和薄膜过滤淋洗法。程序（PROCEDURE） 本公司对无抑菌性的药品采用直接接种法进行方法学验证；具有抑菌性的药品采用薄膜过滤法、培养基稀释法等方法去除抑菌性进行方法验证，若通过验证试验，最终将确认检查条件，批准成为正式检查方法；若不能有效消除抑菌性，将根据具体情况，进行其他抑菌性有效消除的验证试验。 6.1人员要求 进行方法验证的人员需有相关无菌知识背景，经过专门的无菌操作及微生物实验室相关的管理规范和操作规程，具有微生物限度检查资格。 6.2 试验环境 微生物限度检查应在微生物限度检查室进行，其环境要求为万级区域内局部100级的单向流空气区进行，其中全过程必须严格遵守无菌操作。 试验组加菌液和阳性组操作在负压的菌种鉴定室（阳性实验室）内进行。 6.3 仪器设备及实验器具 生化培养箱、霉菌培养箱 、脉动真空蒸汽灭菌器 、超净工作台、单头过滤系统、0.45μm无菌滤膜、无菌培养皿 6.4 培养基及试液 6.4.1培养基：均应是通过促生长试验的培养基： (1) 营养肉汤培养基 (2) 胰蛋白胨大豆琼脂培养基 (3) 营养琼脂培养基 (4) 玫瑰红纳培养基 6.4.2稀释剂及冲洗液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、0.1%蛋白胨水溶液、0.9%无菌氯化钠溶液 6.5 菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC （B）44102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003或ATCC 6538] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [ CMCC(B) 63501或ATCC 6633] 白色念珠菌(Candida albicans) [ CMCC(F) 98001或ATCC 10231] 黑曲霉(Aspergillus niger) [ CMCC(F) 98003或ATCC 16404] 6.6验证试验操作步骤： 6.6.1菌液制备 (1) 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰蛋白胨大豆琼脂培养基中,培养18～24小时（白色念珠菌培养可适当延长至48小时）。 (2) 接种黑曲霉的新鲜培养物至营养肉汤培养基培养24～48小时。 (3) 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每lmL含菌数为30～l00cfu的菌悬液（吸出孢子悬液时，用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)。 6.6.2无抑菌性药品检验方法——直接接种法 供试液制备：称取样品10g，加至90mL适当缓冲液中，混匀，作为1:10的供试液。量取该供试液10mL至另一90mL缓冲液中，混匀，作为1:100的供试液 6.6.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数验证方法 试验组：取供试液1mL和菌液1mL分别注入培养皿中，倾注凉至45℃的琼脂培养基，混匀，凝固后倒置培养。每株试验菌液平行制备2个平皿，细菌用营养琼脂培养基，酵母和霉菌用玫瑰红钠琼脂培养基，两个梯度供试液分别试验。 菌液组：取1mL菌液至培养皿中，加相应培养基培养，测定所加的试验菌数。 供试液对照组：各取1mL供试液注入两个培养皿中，分别加营养琼脂培养基和玫瑰红钠培养基进行培养，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 稀释剂对照组：各取1mL稀释液注入两个培养皿中，分别加营养琼脂培养基和玫瑰红钠培养基进行培养，确定稀释液的无菌性。 6.6.2.2控制菌检查验证方法 试验组：取供试液10mL及1mL大肠杆菌菌液接入100mL胆盐乳糖培养基中。 阴性对照组：取供试液10mL及1mL金黄色葡萄球菌菌液接入100mL胆盐乳糖培养基中。 6.6.3抑菌性药品检验方法