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2004-12-08 EST courses at WIGS EST聚类、常见问题及解决方案 陈 欢 王庭璋 曾晓维 叶琳 浙江大学沃森基因组科学研究院 2006-5 要点： 为什么要聚类？ 如何聚类？ Phrap CAP3 TigrAssembler gap4 结果分析 常见问题及解决方案 为什么要聚类？ 多个EST可能代表同一个转录产物 组成更长、更高质量的序列 减少冗余 利于EST功能的识别 区分不同的剪接产物 基因的表达谱分析 聚类方法 overlap-layout-consensus Phrap, CAP, Staden Package, TigrAssembler, d2_cluster, etc. 功能聚类 其他 聚类前处理 载体检测 污染检测 低质量序列处理 待聚类物种(组织)的高质量转录产物 lesson.seq.screen lesson.seq.screen.qual (可选的) Phrap 基于swat算法 使用全序列质量信息 全基因组、EST 通常与Phred和consed联合应用 /phredphrapconsed.html Phrap 命令及参数 phrap lesson.seq.screen -minmatch 20 -minscore 40 -view -new_ace phrap.out 结果 lesson.seq.screen.contigs lesson.seq.screen.singlets lesson.seq.screen.view lesson.seq.screen.ace phrap.out CAP3 多用于EST序列 /cap/cap3.html CAP3 命令及参数 cap3 lesson.seq.screen –o 21 cap3.out 结果 lesson.seq.screen.cap.contigs lesson.seq.screen.cap.singlets lesson.seq.screen.cap.ace Staden Package 测序项目管理的整合软件包 组装、突变检测、序列分析、序列峰图及对reads文件操纵 基因组、EST UNIX/windows / Pregap4, Gap4 Pregap4是gap4的前处理，在这里你可以处理原始的峰图文件，对序列进行载体和污染检查，同时也可以进行gap4组装。 经pregap4处理所得到的结果，可以通过gap4来进行查看和编辑。 Pregap4, Gap4 命令及参数 Minimum exact match：14 Maximum number of pads：25 Maximum percentage mismatch：5% Maximum consensus length：100000 Maximum database size：8000 结果 lesson.0.aux，lesson.0 lesson.list.report 其它软件 D2_cluster (StackPACK ) http://www.sanbi.ac.za/ TigrAssembler /software/assembler/ DNAStar:综合性序列工具软件，功能很广，名气很大. 囊括分子生物学领域大多数内容. / 结果分析 Contigs + singlets Contigs组成 聚类问题 错拼 poly(A) , Linker-to-linker, Gene Families, repeat 漏拼 Low quality, Linker-to-linker, repeat 选择性剪切 解决方案 Parameters ESTs2Contig Blastn/Blastx search Assemble individually 上机实习 原始数据： 200条没有质量文件的EST序列 162个原始的峰图文件 实习步骤：在windows下操作staden package, 以完成对这些数据的拼接 * 辗郸碗绍特问逸癣砰威尝盲缄妓陀辙浴掣藤酗问子拟嘘婚浇社带惟吸貌影EST聚类拼接EST聚类拼接 目标基因的分析及应用 数据公布，形成文章 cDNA文库的构建 随机挑取克隆进行5’或3’端测序 序列前处理 聚类和拼接 基因注释及功能分类 文库检查！ 揪痊姜拌只拟添因绘辫阻秦蛤芬蝗脓维踩液英体爵唱功卫祝辖日停蕴晕迷EST聚类拼接EST聚类拼接 湿尿曝机蒸罐镑馁紫饵粉氨赢嫩佯咀骑匀辐搞缕炬耐燥漂作宾驻沉着赤椽EST聚类拼接EST聚类拼接 泡巢蔼沥妓碾夯是惯测夷戚疡筋侦褥还蛤炬型铁首啦响俗啡热汞乘蒋钨诚EST聚类拼接EST聚类拼接 砚摹碴毕炎嘱厅罐骋的瘸夫哎哮苦爽冶豌岁