下午-甲基绿-派诺宁染色法检测细胞的凋亡20111027.doc

细胞的凋亡的形态学检测 一、甲基绿-派诺宁染色法检测细胞凋亡 实验目的： 1、了解细胞凋亡在光镜下的细胞学现象。 2、通过实验观察，了解细胞凋亡与死亡的本质不同。 3、通过本实验，熟练掌握甲基绿-派诺宁染色法检测细胞凋亡。 实验原理： 细胞凋亡是指机体在一定的生理、病理条件下，为维持内环境稳定，通过基因控制而使细胞主动有序地死亡，且表现一系列形态和生化方面的特征。是细胞正常的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用，不造成炎症和自体的损伤，是细胞为了更好地适应自下而上环境而主动争取的死亡过程。因这一死亡过程严格受到程序的控制，又称为细胞程序性死亡。 与凋亡不同，细胞坏死是指细胞在各种致损伤因素的作用下无序死亡的过程， 形态特征为细胞胀大，特别是细胞器肿大，胞膜破裂，胞浆内容物外泄，而核变化较慢，DNA降解不充分，局部严重的炎症反应等。 植物细胞凋亡检测方法的实质就是区分正常的细胞、正在进行凋亡的活细胞和坏死或凋亡结束后死亡的细胞。通常主要采用的手段有：形态学观察法、 生化及分子生物学法、 免疫学方法、生理学检测法等。 甲基绿-派诺宁染色法：细胞凋亡和坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA损失。根据这一特点，可利用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，甲基绿对染色质中的DNA选择性结合显示绿色或者蓝色；派诺宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色(呈现红紫色)者为凋亡细胞，呈现阴性染色者（蓝绿色）为坏死细胞。 实验仪器、材料和试剂： （1）仪器、用具：光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、50ml小烧杯、冰箱 （2）材料：洋葱洋葱大蒜甲液：5%Pyronin水溶液（可加热助溶）2%甲基绿水溶液 蒸馏水乙液：1M醋酸盐缓冲液（pH=4.8）甲乙两液分别置4℃冰箱备用，用时混匀。 ：A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100mlB液：醋酸钠13.6克加蒸馏水至100ml取A液40ml＋B液60ml混匀即为pH=4.8的缓冲液一周内有效，用前现配 0.75% 的生理盐水 0.4M NaCl+CaCl2溶液 实验步骤： （1）洋葱鳞茎内表皮 1、取材：用镊子取1 cm2洋葱鳞茎内表皮若干置于生理盐水中。 2、诱导处理：试材分三组，一组用0.4mol/L的NaCCaCl2处理2小时-派诺宁染色液进行染色20min。 4、清洗：用蒸馏水清洗2~3次（注意要彻底）。 5、制片：分别将处理的试材放在载玻片上制片，注意勿产生气泡。 6、镜检：在光学显微镜下，观察是有阳性反应还是有阴性反应。 （2）大蒜根尖 1、取材：用镊子取大蒜根尖若干置于生理盐水中 2、诱导处理：试材分三组，一组用1％H2O2处理4小时-派诺宁染色液进行染色20min. 4、清洗：用蒸馏水清洗2~3次 5、制片：将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片。 6、镜检：在光学显微镜下，观察是有阳性反应还是有阴性反应。 结果观察： 洋葱鳞茎内表皮凋亡细胞（40×10） 葱鳞茎内表皮死亡细胞（40×10） 葱鳞茎内表皮正常细胞（40×10） 二、Giemsa染色法： Giemsa染色法：一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞的染色。正常细胞核染成蓝色或蓝紫色，色泽均一；凋亡细胞可见核固缩、边集或碎裂，染色变深；细胞膜皱折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小体。 三、吖啶橙染色法 荧光染料吖啶橙具有两种不同的染色特点，在已固定的组织它是一种异染性染料，单链核酸呈橙色荧光，双链核酸呈绿色荧光。在活细胞中它是一种pH指示剂，反映溶酶体质子泵功能，AO呈弱碱性，溶酶体内部的pH值较低，AO可透过细胞膜结构进入溶酶体内，并与其内水性水解酶结合而发橘红色荧光。有研究表明凋亡时伴有整个细胞包括细胞核的酸化。溶酶体在此过程中可能发挥了重要作用；溶酶体可能与靶核融合，释放其内容物，降低核内的pH值，促进酸性核酸内切酶的激活，并且溶酶体可能提供酸性环境，促进浓缩核的蛋白成分的分解。凋亡时溶酶体结构基本保持完整，因而可使AO染料进行累积，故凋亡时细胞核与细胞质内均可见致密浓染的橘红色荧光，甚至可见橘红色荧光碎片。而坏死细胞破坏了溶酶体的完整结构，也破坏了累积AO的能力，因而橘红色荧光很浅，甚至没有。 实验试剂、仪器： 吖啶橙，稀释液10×PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.