微生物酶活性试验方法.docx

微生物酶活性试验方法脱氢酶活性测定方法参考：【周春生, 尹军. 一脱氢酶活性检测方法的研究[J]. 环境科学学报, 1996, 4: 400-405.】以及【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】（一）试验方法：（1）水样预处理：取污泥混合液10ml，放入离心管中离心5min后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至10ml搅拌均匀。（2）加试剂：将处理后样品转移至25ml比色管中，依次加入7.5mlTris-HCl缓冲液（PH=8.4）、2.5ml硫酸钠溶液（0.36%）、2.5ml纯水以及2.5mlTTC溶液（0.4%）、混匀。（3）样品培养：将比色管置于37℃条件下水浴恒温振荡器中培养，培养5min后吸取5ml于离心管内，加0.5ml甲醛固定以作样品空白；（4）终止酶反应：继续培养30min，然后向管中加入2ml甲醛终止酶反应；（5）样品萃取：将样品培养液以5.5ml为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min, 弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮, 研磨搅拌混合, 于37℃条件下萃取TF10min后；（6）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液, 于波长485nm处进行比色, 记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差, 查标准曲线, 进而计算出TF的生成速度, 即脱氢酶活性(mg/(L*h))（二）试剂：（1）0.4％三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTC）:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至1L至容量瓶中，棕色瓶保存；（2）Tris-HCl缓冲液：称取6.057gTris（三羟甲基氨基甲烷, 分析纯, 北京化学试剂厂），加入20ml 1mol/LHCl溶液, 再定容至1L；（3）硫酸钠溶液（0.36%）：3.6g硫酸钠（Na2SO3）稀释至1L容量瓶中；（4）TTC标准溶液：称取0.05gTTC定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。（三）标准曲线的绘制：（1）采用1mg/L的TTC标准溶液制备每含20、40、60、80、100、120、140μgTTC系列溶液，即取1、2、3、4、5、6、7ml至50ml容量瓶中，稀释至50ml进行实验；（2）用8试管，分别加入2mlTris-HCl缓冲液、2ml纯水、2ml不同浓度的TTC，第八只不加入TTC；（3）加入10g硫酸钠溶液，TTC被还原为红色的TF；（4）加入5ml丙酮振荡摇匀提取TF（振荡床振荡10次）；（5）离心5min后485nm下测吸光度；（6）吸光度为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘制标准曲线。（四）计算：TF=A*B*CA：标准曲线上读数；B：计算时间矫正值：培养时间/60min；C分光时的稀释倍数，当分光0,8时，稀释分光ATP含量测定方法参考：【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】ATP消化后变为无机磷，制备ATP消化液，测无机磷吸光度以确定ATP含量（一）试验方法：（1）活性污泥稀释1:20，曝气池稀释1:10（保证ATP量在0.1-1.0mg/L之间）；（2）用50ml烧杯加入35ml 的（pH=7.75 0.025M Tris缓冲液）加热至沸腾；然后加入待测活性污泥溶液1ml，煮沸加热30-60s后摇动几分钟放入冰浴中，冷却后加入pH7.75 0.025M的Tris缓冲液至50ml，摇匀过滤，所得过滤液供测ATP；（3）ATP制备液消化：去待测液1ml于比色管中，加入2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128℃,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（4）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45℃水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，利用无机磷含量查Pi-ATP相关曲线，得出ATP值；ATP含量高的污泥，微生物活性越高。（二）试剂：（1）无机磷溶液中间液：烘干后称取0.2195g KH2PO4稀释至500ml容量品；（2）无机磷溶液使用液：上述溶液取10ml稀释至100ml；（3）定磷试剂：6mol/L硫酸：水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸（体积比）=1：2:1:1，配置时按上述顺序加入试剂。溶液配制后当天使用，正常为浅黄绿色，若颜色不正常，则不能使用6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸加入83ml水中，得6mol/L；2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵→100ml容量瓶；10%抗坏血酸：取10g抗坏血酸→100ml容量瓶（棕色瓶冷藏）。（4）ATP：10mgATP（5）pH7.75 0.025M的Tris缓冲液： 3.02785g稀释至5