杂交瘤技术.pptVIP

实验十四 杂交瘤技术 1. 实验目的 掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。 能运用杂交瘤技术来制备自己所需要的单克隆抗体。 2. 实验原理 杂交瘤技术产生的3个技术关键 动物免疫 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选和克隆 细胞融合方法 病毒介导的细胞融合 PEG介导的细胞融合 电激融合 3.实验材料、用品 实验材料8～12周龄BALB/c纯系小鼠10只；SP2/0-AG14骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒（用作抗原）。： 实验用品 仪器与用具：超净工作台、普通离心机、倒置显微镜、酶联免疫检测仪、CO2恒温培养箱、恒温水浴、烤箱、高压灭菌锅。血细胞计数板、25ml和50ml培养瓶、96孔和24孔培养板各、40孔酶标板、50ml塑料离心管、10ml玻璃离心管、lml、5ml和10ml吸管、6cm培养皿、100ml和50ml培养液瓶各、1ml、5ml和10ml注射器各、小滴管、玻璃套管、手术剪刀、手术镊、6号针头、L型6号针头、500ml和1000ml烧杯、酒精灯、不锈钢网(5×5cm 200目)、解剖盘、培养液抽滤灭菌装置。 试剂： RPMI 1640培养基、小牛血清(FCS)、GKN液、50％PEG液、HT培养液、HAT培养液、0.5％胎酚蓝、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、包被液、底物反应液、辣根过氧化物酶—羊(或兔)抗鼠IgG、青霉素、链霉素。 4.实验步骤 4.1 动物免疫 实验使用人轮状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物。 （1）纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。 （2）按每克体重注射0.05g戊巴比妥钠的量进行小鼠腹腔注射，对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，5min后小鼠即进入昏迷状态。 （3）无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30μg的0.1ml人轮状病毒（抗原）液分别注射到两只小鼠脾脏内。 （4）将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。 （5）免疫三天后取脾细胞进行融合。 4.2 细胞悬液的制备与融合 ①脾细胞悬液的制备 取已免疫BALB/c小鼠，于免疫后第三天用眼球放血法处死（收集流出血液制备阳性血清），用70%酒精浸泡消毒5min后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用37℃ GKN液清洗2～3次。向脾内注射0.2ml GKN液后（使脾脏膨胀以利于细胞散开），放人培养皿中，加入5ml GKN液，用L型6号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网将此细胞悬液过滤到一个50ml塑料离心管中，再加入10ml GKN液，混匀后，1000 r/min离心5min，弃上清，用10ml GKN液重新悬浮细胞，取0.1ml均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液放37℃备用。 ②SP2/0-Ag14细胞悬液的制备 将SP2/0-Ag14细胞用RPMl 1640完全培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代三天，使细胞在融合时达到对数生长期。取3～5瓶(50ml的培养瓶)SP2/0-Ag14细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入37℃ GKN液4ml，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液放人一个50ml塑料离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，用10ml 37℃ GKN液将细胞悬浮均匀，取0.1ml作活细胞计数，其余悬液放37℃备用。 ③腹腔巨噬细胞悬液的制备 杂交瘤细胞开始生长时，需要有饲养细胞，一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。取12周龄BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入10ml RPMI 1640完全培养液，按摩腹部1～2min后，用注射器抽出腹腔液（一般可抽出8—9ml），放人一个50ml塑料离心管中，置37℃备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种3～5块24孔或96孔培养板。可根据需接种的培养板数来确定所使用饲养细胞的量。 ①将已计数脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞按6:1的数量比例混合于一个50ml塑料离心管中，1000 r/min离心10min。 ②弃上清液，轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散，放40℃预热1～2min。 ③向已预热的离心管中边摇边在45s内匀速加入1ml 50%PEG溶液。 ④立即在90s内边摇边向管内加速加入15ml 37℃ GKN液，放室温静置10min。 ⑤1000r/min离心10min，弃上清。 ⑥向离心管中加入37℃腹腔巨噬细胞悬液和40ml 37℃的HAT培养液，悬浮均匀。 ⑦将细胞悬液分别接种于二块24孔板（0.5ml/孔）和二块96孔板（0.2ml/孔）中，放37℃ 5%CO2 培养箱中培养。 ⑧每天观察细胞的生