果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速测定吉林省地方标准.doc

前 言 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院。 本标准主要起草人：史艳宇，刘俊会，华蕾，安伟，李媛媛，逄晓阳，王莹，王伟，李刚等。 本标准系首次发布的地方标准。 果汁及果汁制品中脂环酸芽孢杆菌的快速检测--荧光PCR方法 范围 本标准规定了方法。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 定义、术语和缩略语PCR：polymerase chain reaction，简称PCR。　　 3.2.2 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。　　 3.2.10 Ttis: tris(hydroxymethyl)aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 3.2.11 Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。TaqMan方法，在比对脂环酸芽孢杆菌16S r RNA基因序列的基础上，设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针。探针5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示)，3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示)，它在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 试剂和材料 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯5’- CGTAGTTCGGATTGCAGGC -3’ 5’- GTGTTGCCGACTCTCGTG -3’ 探针 5’-FAM-CGGAATTGCTAGTAATCGC-TAMRA-3’ 5.4 Taq DNA聚合酶。 5.5 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。 5.6 DNA提取试剂：0.1%Chelex100水溶液。 5.7 10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（Ph8.4），200 mmol/L氯化钾，15 mmol/L氯化镁。 5.8 脂环酸芽孢杆菌质控菌株：ATCC 49025。 6 仪器和设备 6.1 荧光PCR仪。 6.2 离心机微量移液器10 μL、 μL、00 μL、1 000 μL。 6.4 水浴锅。 7 检验程序 图1 荧光PCR检测脂环酸芽孢杆菌程序图 8 步骤 8.1 取样和增菌 取样前消毒样品包装的开启处和取样工具。以无菌操作取样品25 mL (g)，加在225 mL的K液体培养基中，振摇使样品充分混合后，47℃恒温振荡培养24 h~48 h。 模板DNA准备 取增菌液1 mL加到1.5 mL无菌离心管中，8 000 r/min离心5 min，尽量吸弃上清液；加入50 μL DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混合后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液以待检测（如不能及时检验，可将上清液于-20℃保存）。 也可按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。 荧光PCR检验 反应体系总体积为25 μL，其中含：10×PCR缓冲液2.5 μL、引物（10 μmol/L）各1μL、探针（10 μmol/L）1μL、dNTP（10 mmol/L）1μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、水16 μL、模板DNA 2 μL。反应步骤一：95℃预变性3 min。反应步骤二：95℃变性30 s，55℃退火延伸30 s，同时收集FAM荧光，共进行40个循环。反应产物可在4℃保存。 检验过程中分别设阳性对照、阴性对照。脂环酸芽孢杆菌DNA作阳性对照，以灭菌水作为阴性对照。 9 结果与判断 检验样品Ct值小于或等于35.0时，报告脂环酸芽孢杆菌筛选阳性；样品Ct值大于35.0且小于40.0时，重复一次，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告脂环酸芽孢杆菌筛选阳性，否则报告脂环酸芽孢杆菌未检出；样品检测不到Ct值时，报告脂环酸芽孢杆菌未检出。 10 废弃物处理和防止污染的措施 检验过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。 检验过程中防止交叉污染的措施见附录B。 附 录 A（规范性附录）K液体培养基制作 A.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母提取物 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 吐温-80