树突状细胞转移癌融合疫苗治疗转移性结肠癌研究1.docVIP

树突状细胞/结肠转移癌细胞融合疫苗治疗转移性 结肠癌的动物实验研究 孙新平,丁晓煜,赵文鹏,朱宗迅,李渊,张天锋（武警甘肃总队医院医务处 甘肃 兰州 730050） 【摘 要】目的：通过建立人免疫重建荷人结肠癌皮下种植瘤严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型，研究DC/结肠癌融合疫苗对人转移性结肠癌的发展及预后的影响。方法：应用腹腔注射法对严重联合免疫缺陷SCID小鼠注射人外周血淋巴细胞（hu_PBL）免疫重建后，皮下注射法建立荷人结肠癌皮下种植瘤模型。应用聚乙二醇（PEG) 制备DC/SW620融合疫苗。将DC/SW620融合疫苗于左、右后足底、尾根部皮下三点注射在人免疫重建的SCID小鼠结肠癌皮下移植瘤模型。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中人IgG含量；通过直接测量法观察人结肠癌皮下种植瘤成瘤性和小鼠生存期。结果：融合疫苗治疗组的皮下肿瘤体积生长速度慢于其他各对照组；融合疫苗治疗组生存期为（109.00±17.17）d，明显长于单纯制模组（55.67±12.03，P 0.001）、免疫重建组（81.83±9.06，P 0.001）、肿瘤细胞疫苗组（87.33±12.85，P 0.01）。结论：DC/SW620融合疫苗可抑制肿瘤生长，改善预后，DC/SW620融合疫苗比肿瘤细胞冻融物免疫治疗效果更佳。 [关键词] 结肠癌；树突状细胞；细胞融合；严重联合免疫缺陷小鼠 [中图分类号] R392.12 [文献标识码] A 结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率在西方发达国家分别居恶性肿瘤的第3位和第2位[1-2] 。目前除外科手术、化学疗法和放射疗法外，免疫治疗作为辅助治疗新途径，日益受到研究者的关注。它治疗的靶点和毒性作用与传统治疗措施没有重叠,靶向性好，产生的记忆性免疫效应细胞可预防肿瘤复发。其中树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗在针对多种恶性肿瘤的研究中取得了抗肿瘤作用[2、3-5]。本研究拟通过建立人免疫重建荷人结肠癌皮下种植瘤SCID小鼠模型，研究DC/结肠转移癌融合疫苗对人结肠癌发展以及预后的影响。 1材料和方法 1.1 材料 SCID小鼠：无免疫渗漏( IgG 1μg/ ml)的C.B17/SCID纯系小鼠，雄性，4~6周龄，30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于无特殊病原体（SPF）环境（北京大学医学部动物实验中心），饲料、饮水、垫料等均经无菌消毒。人结肠转移癌细胞株SW620由上海细胞所购入。健康人浓缩白细胞，购自北京市红十字会中心血站。50%聚乙二醇（PEG）购自Sigma公司（美国）。人IgG ELISA试剂盒购自Pierce公司（美国）。其他试剂为市售高级试剂。 1.2 方法 1.2.1 人外周血淋巴细胞（hu-PBL）及DC的分离培养：用淋巴细胞分层液密度梯度离心法从健康人浓缩白细胞中分离出人外周血单个核细胞，以含5%人血清的RPMI1640培养，24h后吸取未贴壁细胞（主要为淋巴细胞），用RPMI1640+5%人血清培养，并加入20U/ml IL-2培养24小时后用以对SCID小鼠的免疫重建；贴壁的细胞则继续用RPMI1640+5%人血清培养，并加入1000U/ml rhGM-CSF和1000U/ml IL-4，培养第6天加入TNF-α800U/ml使树突状细胞成熟。 1.2.2 DC/SW620融合疫苗的制备：结肠转移癌细胞株SW620以含5%胎牛血清的RPMI1640培养，常规换液传代。DC与SW620细胞按1:3的比例混合，室温下用PEG融合法融合。 1.1.3免疫重建荷人结肠癌皮下移植瘤模型建立及治疗：（1）实验分组：将30只SCID小鼠随机分为A假手术组、B单纯制模组、C免疫重建组、D融合疫苗治疗组、E肿瘤细胞疫苗组五组，每组6只。（2）腹腔注射法免疫重建：在第1周，C、D、E组腹腔注射300 μL含3×107hu_PBL的PBS，A、B组腹腔注射等量不含hu_PBL的PBS。（3）皮下注射法建立结肠癌皮下种植瘤模型：第2周，B、C、D、E组小鼠于右腋下注射150 μL含5×106SW620细胞的PBS，A组小鼠注射不含SW620细胞的等量PBS。（4）皮下注射法免疫治疗：DC/SW620融合疫苗和SW620细胞冻融物在注射前经过Co-60射线30 GY剂量照射，以杀灭其中残留的肿瘤细胞。第3周，D组在左、右后足底、尾根部注射含1×107DC/SW620融合疫苗的PBS每部位50 μL，E组于相同部位注射含1×107SW620细胞冻融物的PBS每部位50 μL第4周、第5周D、E组重复上述治疗，共3次。 1.2.4皮下移植瘤模型的疗效评估： B、C、D、E组制模后每周测量小鼠皮下瘤的最长径dmax和最短径dmin，体积V=0.52×dmin2 ×dma