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树脂切片的制作
观察细胞最常用的方法是先制作切片,然后用显微镜观察。以下介绍用低粘性Spurr树脂包埋植物材料,用半/超薄切片机切片的方法。
一、器具与试剂
1.器具 电子天平、振荡机、70℃恒温箱、玻璃制刀机、半/超薄切片机、显微镜、包埋模、制刀用的玻璃条、制刀用的胶带和石蜡、镊子、刀片、管瓶、滴瓶、切样用的塑料板等
2.试剂 (1)缓冲溶液:0.05mol/L CaCo(sodium cacodylate 二甲基砷酸钠) pH7.2 (2)固定剂: ①前固定液:2%~3%GAL(glutaraldehyde 戊二醛) 1%PAL(paraformaldehyde 多聚甲醛) 0.05mol/L CoCo pH7.2 ②后固定液:0.5%~1%OsO4 (3)脱水剂:20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%的乙醇;环氧丙烷 (4)树脂:Spurr树脂 (5)染色剂:0.5%~1% TBO(toluidine blue-O 甲苯胺蓝-O),用0.1%碳酸钠配制。
二、Spurr树脂的配制
Spurr树脂是由四种试剂按比例配制而成(表1),其中可塑剂的用量调节包埋块的硬度。
表1 Spurr树脂常用的配方
试 剂
配方1 (稍硬)
配方2 (适中)
配方3 (稍软)
1.主 剂:ERL-42062.可塑剂:DER-736 3.硬化剂:NSA 4.催化剂:S-1
10.0g5.5g26.0g0.4g
10.0g6.0g26.0g0.4g
10.0g6.5g26.0g0.4g
配制时,盛树脂的烧杯放在电子天平上,按表中试剂的序顺,边滴入试剂边称量,每加入一种试剂要充分搅拌后再加另一种试剂。 盛树脂的烧杯要烘干,树脂配制好后,盛树脂的烧杯要用塑料纸封口,防止树脂吸湿。树脂要随配随用,配制好树脂只能在冰箱中存放2天。
图1称样
通常每一个样品需要用4~5ml树脂,按样品数计算总量,分二次配制,一次在浸渗开始时配制,另一次在最后一次更换纯树脂时配制。
三、操作方法
1.材料的固定 (1)管瓶编号:根据固定样本数编写管瓶号码,瓶号用铅笔写,而不用元珠笔(有机溶剂会溶去元珠笔油)写。 (2)前固定:用双面刀片将植物材料切成1mm厚的薄片,把薄片放入盛有1~2ml前固定液的管瓶(可用青霉素小瓶代替)中,通常每个管瓶处理1个样品,每一样品选择10个薄片作固定与包埋,固定时要将管瓶盖盖紧。作好记载(各瓶中放哪一样品)。将管瓶放在振荡机上低速振荡3h左右。 (3)清洗:前固定后,用吸管吸去管瓶中的前固定液,并加入1~2ml缓冲液于管瓶,将管瓶放在振荡机上低速振荡,10min后吸去缓冲液,共清洗3次,每次10min。 (4)后固定:清洗后,管瓶中加入0.5ml后固定液。振荡固定3h左右,使固定材料逐渐变黑(蛋白质含量高的材料黑化程度高)。后固定过程也可在冰箱中进行(即过夜)。 2.脱水 所谓脱水,就是用乙醇或丙酮等有机溶剂浸渍已固定的材料,逐步除去样品中的水分。脱水过程如下: (1)用吸管吸去管瓶中的后固定液,用缓冲液或重蒸水清冼管瓶和固定的材料三次,每次10min。 (2)用20%、40%、60%、80%、90%、95%的乙醇分别浸渍固定的材料,每种浓度处理20~30min。 (3)100%乙醇浸渍材料3次,每次30min。 3.置换 树脂易溶于环氧丙烷(proprlene oxide,PO)中,为了使树脂能很好地渗入植物组织与细胞,须用环氧丙烷置换材料中的乙醇,方法如下: (1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml环氧丙烷(alc:PO≈7:3),处理材料10min。 (2)向管瓶中追加1ml环氧丙烷(使alc:PO≈5:5),处理材料10min。 (3)向管瓶中再追加2ml环氧丙烷(使alc:PO≈3:7),处理材料10min。 (4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和环氧丙烷混合液,加入纯环氧丙烷3次,每次10min。 在置换过程中管瓶要盖紧盖子,一防环氧丙烷挥发使样品干燥,二除空气中湿气进入有机溶液。 4.浸透 浸透的目的是让树脂渗入植物组织与细胞,需化较长的时间。过程如下: (1)在管瓶中加入1ml环氧丙烷,向内滴入1滴Spurr树脂,将管瓶放在振荡机上低速振荡1~2h。 (2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂,使Spurr树脂的浓度逐渐提高,每滴加一次Spurr树脂,振荡1~2h,共滴加0.3ml左右的树脂,使树脂浓度达到25%左右。 (3)用吸管吸去管瓶中0.5~0.8ml的
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