树脂切片的制作.doc

　　观察细胞最常用的方法是先制作切片，然后用显微镜观察。以下介绍用低粘性Spurr树脂包埋植物材料，用半/超薄切片机切片的方法。 一、器具与试剂 　　1.器具　　电子天平、振荡机、70℃恒温箱、玻璃制刀机、半/超薄切片机、显微镜、包埋模、制刀用的玻璃条、制刀用的胶带和石蜡、镊子、刀片、管瓶、滴瓶、切样用的塑料板等 　　2.试剂　　(1)缓冲溶液：0.05mol/L CaCo(sodium cacodylate 二甲基砷酸钠) pH7.2　　(2)固定剂：　　　①前固定液：2%～3%GAL(glutaraldehyde 戊二醛) 1%PAL(paraformaldehyde 多聚甲醛) 0.05mol/L CoCo pH7.2　　　②后固定液：0.5%～1%OsO4　　(3)脱水剂：20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%的乙醇；环氧丙烷　　(4)树脂：Spurr树脂　　(5)染色剂：0.5%～1% TBO(toluidine blue-O 甲苯胺蓝-O)，用0.1%碳酸钠配制。 二、Spurr树脂的配制 　　Spurr树脂是由四种试剂按比例配制而成(表1)，其中可塑剂的用量调节包埋块的硬度。 表1 Spurr树脂常用的配方 试 剂 配方1 (稍硬) 配方2 (适中) 配方3 (稍软) 1.主 剂：ERL-42062.可塑剂：DER-736 3.硬化剂：NSA 4.催化剂：S-1 10.0g5.5g26.0g0.4g 10.0g6.0g26.0g0.4g 10.0g6.5g26.0g0.4g 　　配制时，盛树脂的烧杯放在电子天平上，按表中试剂的序顺，边滴入试剂边称量，每加入一种试剂要充分搅拌后再加另一种试剂。　　盛树脂的烧杯要烘干，树脂配制好后，盛树脂的烧杯要用塑料纸封口，防止树脂吸湿。树脂要随配随用，配制好树脂只能在冰箱中存放2天。 图1称样 　　通常每一个样品需要用4～5ml树脂，按样品数计算总量，分二次配制，一次在浸渗开始时配制，另一次在最后一次更换纯树脂时配制。 三、操作方法 　　1.材料的固定　　(1)管瓶编号：根据固定样本数编写管瓶号码，瓶号用铅笔写，而不用元珠笔(有机溶剂会溶去元珠笔油)写。　　(2)前固定：用双面刀片将植物材料切成1mm厚的薄片，把薄片放入盛有1～2ml前固定液的管瓶(可用青霉素小瓶代替)中，通常每个管瓶处理1个样品，每一样品选择10个薄片作固定与包埋，固定时要将管瓶盖盖紧。作好记载(各瓶中放哪一样品)。将管瓶放在振荡机上低速振荡3h左右。　　(3)清洗：前固定后，用吸管吸去管瓶中的前固定液，并加入1～2ml缓冲液于管瓶，将管瓶放在振荡机上低速振荡，10min后吸去缓冲液，共清洗3次，每次10min。　　(4)后固定：清洗后，管瓶中加入0.5ml后固定液。振荡固定3h左右，使固定材料逐渐变黑(蛋白质含量高的材料黑化程度高)。后固定过程也可在冰箱中进行(即过夜)。　　2.脱水　　所谓脱水，就是用乙醇或丙酮等有机溶剂浸渍已固定的材料，逐步除去样品中的水分。脱水过程如下：　　(1)用吸管吸去管瓶中的后固定液，用缓冲液或重蒸水清冼管瓶和固定的材料三次，每次10min。　　(2)用20%、40%、60%、80%、90%、95%的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度处理20～30min。　　(3)100%乙醇浸渍材料3次，每次30min。　　3.置换　　树脂易溶于环氧丙烷(proprlene oxide，PO)中，为了使树脂能很好地渗入植物组织与细胞，须用环氧丙烷置换材料中的乙醇，方法如下：　　(1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml环氧丙烷(alc:PO≈7:3)，处理材料10min。　　(2)向管瓶中追加1ml环氧丙烷(使alc:PO≈5:5)，处理材料10min。　　(3)向管瓶中再追加2ml环氧丙烷(使alc:PO≈3:7)，处理材料10min。　　(4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和环氧丙烷混合液，加入纯环氧丙烷3次，每次10min。　　在置换过程中管瓶要盖紧盖子，一防环氧丙烷挥发使样品干燥，二除空气中湿气进入有机溶液。　　4.浸透　　浸透的目的是让树脂渗入植物组织与细胞，需化较长的时间。过程如下：　　(1)在管瓶中加入1ml环氧丙烷，向内滴入1滴Spurr树脂，将管瓶放在振荡机上低速振荡1～2h。　　(2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每滴加一次Spurr树脂，振荡1～2h，共滴加0.3ml左右的树脂，使树脂浓度达到25%左右。　　(3)用吸管吸去管瓶中0.5～0.8ml的