植物材料蛋白样品制备和应用实例.doc

植物样品制备方法（TCA-丙酮沉淀法） 植物样品多含有酚类色素等杂质，故多使用TCA-有机溶剂沉淀法去除酚类色素等杂质，以利于蛋白的抽提。需要注意的是TCA有利于去除酚类色素等杂质，但不利于蛋白的抽提，使用浓度不宜过高，在使用蛋白提取液抽提蛋白之前应尽量除去。 1.需要制备的植物样品置于液氮中冷却，并且将10%的TCA-丙酮溶液和丙酮置于-20℃冰箱中进行预冷； 2.在干净的研钵中加入液氮进行预冷，样品于液氮中进行研磨，重复加液氮研磨至粉末状； 3.取出磨好的样品用10倍（质量体积比）10%的TCA-丙酮溶液悬浮，加入终浓度 为1 mM PMSF、2 mM EDTA、10 mM DTT，超声1分钟，于-20℃冰箱静置2小时（或过夜） 后，4℃，35,000g，15分钟离心，弃上清； 4.沉淀用样品10倍体积的丙酮重悬浮，加入终浓度为1 mM PMSF、2 mM EDTA、10 mM DTT，于-20℃下静置2小时后，4℃，35,000g，15分钟离心，弃上清； 5.重复步骤4两次； 6.取出沉淀真空干燥约5分钟，除尽有机溶剂； 7.按10 mg样品干粉末加200 ul蛋白抽提液（不同样品存在差异，常用的为8 M 尿素、4% CHAPS、0.5-2% 两性电解质（PH 3–10）、40 mM Tris base pH 8.5）的比例，加入1 mM PMSF、2 mM EDTA、10 mM DTT，超声5分钟，充分溶解 1小时，10℃，40,000g，15分钟离心，上清为所需的蛋白溶液； 8.Bradford法测定蛋白样品的蛋白浓度。 应用实例1：杂交水稻种子遗传谱系的蛋白质组学研究 Xie ZS, et al. Pedigree analysis of an elite rice hybrid using proteomic approach. Proteomics 2006, 6, 474–486. 植物的优势定义常常基于单位面积产量和谷粒重量等描述性特征，然而这些特征缺乏分子水平的信息，很难精确预测子代的表型信息。对于水稻而言，杂交水稻的遗传信息可以通过分析水稻种子而获得。研究者以9311、PA64S和两者杂交子代 LYP9的种子为研究样本，分别对种子的胚乳和胚表达的蛋白质表达谱进行了研究。研究发现胚乳的蛋白质表达谱在三种水稻样品中非常相似；而水稻胚的蛋白质表达谱数目却存在显著性的降低，进一步胶图分析发现三种水稻样品的胚中蛋白质斑点存在显著性差异。认真分析后发现，在亲本和子代蛋白质表达谱中存在镜相 相关，LYP9胚中所表达的蛋白质都可以在亲本中检测到，表明了它们之间的遗传谱系。这项研究表明蛋白质组学方法对于植物的遗传谱系分析和功能预测有重要的 作用和价值。 图：三种水稻种子的形态和胚的双向电泳胶图比较。亲本和子代之间的一些镜相蛋白质斑点被展示。应用实例2：水稻叶不同发育阶段的蛋白质组学研究 Zhao CF, et al. Proteomic changes in rice leaves during development of field-grown rice plants. Proteomics 2005, 5, 961–972. 在影响水稻产量的众多影响因素中，水稻叶将光能转变为生物能的能力有着重要作用。研究者收集了6个不同发育阶段的水稻叶样品，进行了蛋白质组学的研究，通过双向电泳技术分析了这些样品的蛋白质表达谱，发现了49个差异表达的蛋白质斑点，并成功鉴定了其中89.8%的蛋白质。研究发现：（1）水稻叶表达的蛋白质在发育过程中表达降低，尤其是一些叶绿体蛋白质，虽然这种变化很缓慢和平稳。（2）水稻叶的主要蛋白质RuBisCO在不同发育阶段恒定表达，有趣的是，在所有研究的样品中发现RuBisCO大亚基存在高比例的降解。（3）抗氧化蛋白质，如superoxide dismutase和peroxidase，在成熟的早期阶段表达降低。 图：水稻不同发育阶段表达改变的蛋白斑点。（A）60 kDa chaperonin（左）和RuBisCO binding protein（右）在水稻叶发育过程中表达降低。（B）一个未知蛋白在水稻叶发育过程中呈现先表达升高后降低的表达趋势。 应用实例3：水稻愈伤组织分化的蛋白质组学研究 Yin L, et al. Proteomic and transcriptomic analysis of rice mature seed-derived callus differentiation. Proteomics 2007, 7, 755-768. 愈伤组织的分化是水稻再生的关键发育阶段。为了更好的理解这一复杂的发育过程，研究者应用双向电泳技术研究了愈伤组织分化的早期阶段的蛋白质表