流式细胞仪常用的几种检测方法.docVIP

流式细胞仪常用的几种检测方法 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； ?附:细胞固定的一般步骤 1)??????? 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2)??????? 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3)??????? 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4)??????? 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。在4℃条件下可保存2~3周。 ?注意： 2?????? 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2?????? 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2?????? 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2?????? 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2?????? 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2?????? 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2?????? 上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1)??????? 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2)??????? 500g离心5分钟； 3)??????? 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4)??????? 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5)??????? 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1)??????? 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2)??????? 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3)??????? 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4)??????? 调整细胞浓度为1×106/ml； 5)??????? 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡） 2?????? 收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml； 2?????? 离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞; 2?????? 1500rpm离心，5分钟 ，弃去PBS； 2?????? 加PI染液1ml，室温避光20分钟； 2?????? 调整细胞浓度5×105/ml； 2?????? 上机检测。 2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡 1)??????? 常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先溶??????????????????????????? 血),取约5×106个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl 1×Binding Buffer重悬； 2)??????? 分成a、b、c、d、e五管，每管约1×106个细胞 a)??????? 阴性对照，不加任何试剂； b)??????? 阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5μl,室温10min,用1×Binding Buffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μl PI避光15分钟??? c)??????? 加10μl PI，避光孵育15分钟； d)??????? 加5μl AnnexinV液，室温避光孵育15min； e)??????? 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室温避光孵育5min； 3)??????? 每管各加400μl 1×Binding Buffer。 4)??????? 上机检测。 注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞； b. 操作时注意避光； c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。 3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡 1)??????? 放置0.5~1×106个细胞到试管中； 2)??????? 室温离心200g，6min； 3)??????? 弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100μg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min； 4)??????? 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min； 5)??????? 弃上清，加入20μl PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80μl PBSF液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟； 6)??????? 加入2ml PBSF液，室温离心200g，6min； 7)??????? 弃上清，加入1ml PBSF液重悬细胞； 8)??????? 避光保存，直到流式细胞仪检测。 ??????? PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。 三、用流式细胞术进行DNA周期分