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木聚糖酶检测方法
木聚糖酶活力的测定
1 原理
木聚糖酶能将底物木聚糖(本实验采用Xylan from oat spelt,燕麦木聚糖,Sigma NO. :X0627)降解成寡糖和单糖,具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算待测木聚糖酶的活力。
2 木聚糖酶活力单位(U)的定义
在40℃、pH值为5.0的条件下,1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 μmol还原糖(以木糖表示)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。其中样品的酶活力以 U / g(固体酶)或U / mL(液体酶)表示。
Xylan from birch wood)山毛榉木聚糖(Xylan from beechwood)
3 主要仪器
3.1 分光光度计
3.2 精密电子天平
0.0001 g。
3.3 恒温水浴锅
3060℃可调,精度为0.1℃。
3.4 酸度计
精确至0.01。
3.5 秒表
每小时误差不超过5s。
3.6 刻度试管15mL)
带玻璃塞,10支以上。
3.7 移液管0.5、1、2、5、10mL
3.8 分样筛
孔径为0.25 mm(60目)。
3.9 分析天平
0.001 g。
3.10 磁力搅拌器
附加热功能。
3.11 电磁振荡器
3.12 烧结玻璃过滤器
孔径为0.45 μm。
3.13 离心机
3000 r/min
3.14 冰箱
4 试剂与溶液配制
除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的二级水。
4.1 氢氧化钠(NaOH)溶液浓度为200 g/L
称取氢氧化钠20.0g,加水溶解,定容至100mL。
4.2 乙酸(CH3COOH)溶液浓度为0.1 mol/L
吸取冰乙酸0.60mL,加水溶解,定容至100mL。
4.3 乙酸钠溶液(CH3COONa)浓度为0.1 mol/L
称取三水乙酸钠1.36g,加水溶解,定容至100mL。
4.4 乙酸——乙酸钠(CH3COOH — CH3COONa)缓冲溶液浓度为0.1 mol/L,pH为5.0
称取三水乙酸钠19.17 g,加入冰乙酸3.60 mL。再加水溶解,定容至2000 mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.0,再用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.0。用精密pH试纸检定。
4.5 木糖(C5H10O5)溶液浓度为10.0 mg/mL
称取无水木糖1.000 g,加乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)溶解,定容至100 mL。
4.6 木聚糖溶液浓度为10.0g/L
称取木聚糖(Sigma X0627)1.00 g,加入0.32g氢氧化钠,再加入90 mL水,磁力搅拌,同时缓慢加热,直至木聚糖完全溶解。然后停止加热,继续搅拌30 min,加入0.8 mL冰乙酸。继续磁力搅拌,测定其pH值。如果pH值为5.0,用乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)定容至100 mL。如果pH值偏离5.0,再用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.0,然后再用乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)定容至100 mL。木聚糖溶液能立即使用,使用前适当摇匀。4℃避光保存,有效期为3天。
4.7 DNS试剂
称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g(化学纯),加水500 mL,搅拌5 s,水浴至45℃。然后逐步加入100 mL氢氧化钠溶液(4.1),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃。)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45℃水浴加热,同时补加水300 mL,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存。室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月。
4.8 乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液
量取100mL乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液,加入0.15gTriton X-100(曲拉通100),0.15g牛血清白蛋白(BSA)混合均匀。如果pH值偏离5.0,再用乙酸溶液(4.2)或乙酸钠溶液(4.3)调节至5.0。
5 标准曲线的绘制
吸取乙酸——乙酸钠缓冲溶液(4.4)2.0 mL,加入DNS试剂(4.7)3.0 mL,沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温,用水定容至15.0 mL,制成标准空白样。
分别吸取木糖溶液(4.5)3.00、4.00、5.00、6.00 7.00和8.00mL,分别用缓冲溶液(4.4)定容至100 mL,配制成浓度为300、400、500、600、700、
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