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徐州二中2011届生物知识点汇总（选修三模块） 考点一、基因工程：基因工程的诞生、基因工程的原理及技术、基因工程的应用、蛋白质工程 一．基因工程的概念 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 生物体外 基因 分子水平 剪切→拼接→导入→表达 人类需要的基因产物 由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。 二．基因工程的基本工具 （一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 2．功能：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 （二）“分子针线”——DNA连接酶 1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (三) “分子运输车”——载体 1.载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 2.基因工程常用的载体有： 质粒 、 噬菌体 和 动、植物病毒 等。最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。 DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较 DNA连接酶 DNA聚合酶 不同点 连接的DNA 双链 单链 模板 不要模板 要模板 连接的对象 2个DNA片段 单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上 相同点 作用实质 形成磷酸二酯键 化学本质 蛋白质 三．基因工程的基本过程 (一) 获得目的基因 1.获取方法主要有两种： ①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。（将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体细菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库，建立基因文库，便于随时获取目的基因。） ②用人工的方法合成：常用方法有反转录法（根据mRNA反转录形成双链DNA）和化学合成法（知道了蛋白质的氨基酸序列推测出mRNA,再推测出结构基因的核苷酸序列，利用游离的4种脱氧核苷酸合成DNA） 获得原核细胞的目的基因可采取直接分离（鸟枪法），获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。 2.利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增目的基因 （1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 （2）目的：获取大量的目的基因 （3）原理：DNA双链复制 （4）特点：指数形式扩增 （5）过程：每一次循环都包括：第一步：加热至90～95℃DNA解旋链为单链（变性）；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合（退火）；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成（延伸）。 (二) 制备重组DNA分子（基因表达载体的构建，这是基因工程的核心） 1．重组DNA分子（基因表达载体）的组成：除了目的基因外，还必须有启动子（RNA聚合酶识别和结合的部位，位于基因首端）、终止子（终止信号，位于基因尾端）、标记基因（鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。） 2．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。 (三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞，只有这个步骤没有发生碱基互补配对） 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法：①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。③将目的基因导入微生物细胞：CaCl2处理法。（在Ca2+作用下使受体细胞变成感受态细胞，感受态细胞在基因表达载体的缓冲液中能吸收DNA分子） (四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定） 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。 2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。 4.有时还需