检化员微生物培训讲解.ppt

无菌洗脱液 ＋ 初始污染 菌样品 ＋ 100cfu 菌种 1.试验组 3.样品对照组 初始污染菌方法验证（药典） 在3次独立的平行试验中: 洗脱液对照组(4)的菌回收率应均不低于70%。（4/2）×100％ 试验组(1)的菌回收率应均不低于70% （1-3）/2×100％ 2.菌液组 4.洗脱液对照组 100cfu/ml 菌种 无菌洗脱液 ＋ 初始污染 菌样品 无菌洗脱液 ＋ 100cfu 菌种 初始污染菌方法验证（ISO11737） 选用灭菌产品，如果洗脱技术中用到洗脱液，每一产品都应经受常规微生物洗脱技术，则将一定数量的易受破坏的微生物放人洗脱液中，回收微生物。 选用灭菌产品，如果产品直接放人培养基中，可以参照无菌实验的抑菌实验进行。 灭菌产品 ＋ 100cfu 菌种 常规洗脱 回收细菌数 100cfu/ml 菌种 1 实验组 2 对照组 实验组回收细菌数/对照组菌数×100％≥70％ 初始污染菌方法验证（ISO11737） 微生物实验仪器 菌 落 计 数 仪 微生物实验仪器 生化培养箱 微生物实验仪器 厌氧培养箱 微生物实验仪器 烛 缸 微生物实验仪器 恒温振荡培养箱 微生物实验仪器 -80℃低温冰箱 微生物实验 实验前 实验中 实验后 环境控制 培养基质量 灭菌控制 人员控制 无菌操作 方法验证 灵敏度实验 无菌检查 无菌实验 初始污染菌 B/F 验证洗脱液 验证样品无抑菌作用 仪器校正 沉降菌检测 简化操作 实验七 革兰氏染色 革兰氏染色步骤 涂片：用纱布擦净玻璃片，以无菌接种环取一小滴无菌生理盐水，然后用无菌接种环挑取少数菌苔（落）或液体培养基培养物（不必加盐水），在玻璃片中央涂成一薄膜。 干燥：涂片后放室温中自然干燥。 固定：将玻片迅速通过火焰3次（其目的是杀死细菌），使菌体与玻片粘附牢固，以及改变对染料的通透性。 初染：滴加结晶紫染液于已固定的玻片上，染1min，水洗。 媒染：滴加碘液，作用1min，水洗。 脱色：加95％酒精于涂片上，轻轻摇动7～8次，使均匀脱色至涂面无紫色或稍成淡紫色，立即水洗。 复染：用石炭酸复红稀释液染0.5min，水洗，用滤纸吸干。于涂片上滴加少许香柏油，镜检。 革兰氏染色：镜检 镜检：用油镜观察标本时，先以低倍镜对光，光线宜强，并开大光圈升高集光器。从侧面转动选择油镜头，将油镜头浸于涂片油内，然后由目镜中观察物象，观察时可先调粗调节器，当看到物像时，再旋转细调节器，直至物像清晰为止。 结果：菌体呈紫色者为革兰阳性；呈红色者为革兰阴性。 （注：显微镜是较贵重的仪器设备，宜轻巧操作，并按说明书规定的方法使用和保养。油镜是显微镜中最宝贵的部分，用后一定要立即用擦镜纸拭去油渍。若油干涸，可用二甲苯少许涂于擦镜纸上，擦去油，并将物镜转换成八字形，存放于箱内。） 实验八 物体表面细菌总数 物体表面细菌总数 方法：将内径为5cm×5cm的灭菌规格板，放在被检物件体表面，根据物体表面积大小，采平行样l～4个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹10次（往返计为1次），将棉拭子放入l0ml灭菌生理盐水的采样管中。 物体表面细菌总数 将每个采样管震打80次，混匀，10倍递减稀释，每个稀释度（取3个稀释度）分别取1ml放于灭菌培养皿（每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养24h,观察结果，取菌落数为30～300的培养皿计算，求出平均菌落数。 菌数（cfu）/cm2= 平均菌数×稀释倍数/采样面积（cm2） 实验九 生产人员手细菌总数 生产人员手细菌总数 方法：被检人五指并拢，将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根处往返涂抹10次后，将棉拭子放入10ml灭菌生理盐水的试管中。 生产人员手细菌总数 将每个采样管震打80次，混匀，10倍递减稀释，每个稀释度（取3个稀释度）分别取1ml放于灭菌培养皿（每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养24h,观察结果，取菌落数为30～300的培养皿计算，求出平均菌落数。 菌落数（cfu）/每只手=平均菌数×稀释倍数 平皿计数法计数原则 1.先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。 2.首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为细菌总数(见例1)。 3.若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比