液相阻断ELISA检测方法.doc

一、亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 试验操作方法 一、试验器材准备 1.移液器:5-50μl移液器、0.2—10μl移液器、50—200μl移液器、50—300μl 12道移液器各一把。 2.移液枪尖 (若干)。 3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。 4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。 二、试剂准备 1.包被缓冲液(PH9.6) 将所购试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4℃存放,1月内有效。 2. 洗涤液(PBST) 将试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4) 3.底物溶液 取1片柠檬酸—磷酸盐片剂(试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml∕瓶 ), 避光之-2O℃保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10μL 本试剂盒配备的 3% 的双氧水(H202) 。 三、操作步骤 1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50μl, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。 图 1 96 孔酶标板检测 10 份样品布局图 S1 1:8 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 -1:4 1:16 1：64 1:8 1:32 1：128 1:64 1：256 1:128 1：512 1:256 1:1024 1:512 1:2048 1:l024 1:4096 图 1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 20 份样品布局图。 2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应 根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。 图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图 S1 1:32 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 -1:4 1:64 1:64 1:8 1:128 1:128 1:256 1:256 S1 1:32 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 1:512 1:64 1:1024 1:128 1:2048 1:256 1:4096 以图 1 为例 , 在 U 型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4 开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50 μ l 用 PBST 稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原对照孔加100μl。振荡混匀,封板,4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。 3.用洗涤液 (1×PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50μl封板,37℃温育1小时。 4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗 血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50μl,封板,37℃温育1小时。 5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 l×PBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 每孔加 50 μl 封板 ,37 ℃温育 1 小时。 6. 同上洗板5次,每孔加50μl底物溶液 (务必加双氧水),37℃温育15分钟。每孔再加50μl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。 四、结果判定 1. 试验认可标准 每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50μl/孔,病毒抗原对照OD492nm 值应在1.5±0.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:8。 2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值) 抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492