绿色木霉N-15菌株固态发酵条件优化研究-健雄职业技术学院.docVIP

绿色木霉N-15菌株固态发酵条件优化研究 潘亚妮 （健雄职业技术学院 化学工程系，江苏 太仓 215411） 摘　要：为提高从土壤中分离筛选得到的耐低温木霉N-15菌株的产孢量，采用单因素实验，对其固态发酵条件进行了优化研究。结果显示：在含麸皮、苹果渣及无机盐的固料中，接种量8%(孢子液/固料)，pH 7.0，拌水量20%，发酵采用前期24℃、中期20℃、后期26℃的变温发酵处理，固料厚度2㎝，每4～5h搅拌并喷水一次，发酵7～9d，孢子密度可达1010个/克以上。该方法具有操作简单、成本低廉，孢子活性稳定，易于保存和运输等优点。 关键词：绿色木霉；固态发酵；条件优化 中图分类号：Q815文献标识码：A 木霉菌(Trichoderma,spp)属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，粘孢菌类，是一类分布广泛的土壤习居菌[1]。除个别为弱病原菌外，大多数对植物病原真菌具有拮抗作用，可利用各种简单或复杂的碳源和氮源，甚至还有转化和降解一些有害或持久存在的污染物的能力[2]。它能产生多样的拮抗作用，主要有竞争作用、重寄生作用、产生抗生物质和溶菌酶类，具有寄生的广谱性[35]。由于这些特点，木霉作为一种具有较高研究价值的真菌病原菌拮抗菌得到了广泛和深入的研究，并取得了较大的成果[6]。我们经过对多株绿色木霉筛选，得到一株绿色木霉菌（T.viride N-15）。该菌可通过营养争夺、重寄生和产生溶菌酶等三种形式抑制灰霉菌丝的生长或引起菌丝变形和消解，同时又不产生抗生物质，对人和动物无毒害，同时对果库和大棚的灰霉病菌具有明显的抑制和杀死作用。为了获得较高和有效的生物量，本实验对N-15 进行了固体发酵条件优化研究，目的是筛选最佳的营养配方和生长条件，为规模化生产木霉N-15提供理论依据。 1 材料与方法 材料 菌株：木霉N-15（前期实验筛选并保存） 培养基： 种子培养基: 土豆20%葡萄糖2%琼脂1.5～2%水1 000 mpH自然。 固体发酵培养基：分别以麸皮、苹果渣、 猕猴桃渣、花生粉壳、麦杆粉、谷壳粉、麦壳粉为固料，KH2PO4 0.24‰，MgSO4 0.18‰，NaHCO3 0.5‰，水30%，组成不同的培养基。 方法 1 培养及发酵 种子培养：斜面PDA培养基接种后置于20℃培养箱中培养3 d，菌丝灰白，菌落呈淡绿色即可。 孢子液的制取：取培养好的种子斜面，加5 m无菌水，振荡，将孢子洗脱至无菌三角瓶中，稀释至孢子浓度为1×104个/m，待用。 固体发酵实验：发酵培养基加水拌匀后，装于布袋，间歇（隔夜）灭菌两次，121℃，30 min/次，置于消毒后的容器中，将制好的孢子液按一定比例接于固料中，充分混均，以一定厚度平铺于消毒后的筛筐中上下均盖2层纱布，于发酵室，初设24 ℃，定时搅拌，喷水及通入无菌空气，进行发酵。 2 孢子浓度的测定称取1 mg发酵固料，放入10 m无菌水中，充分震荡，静置，取上清液1 m，梯度稀释至10?10，显微镜下计数。发酵培养基确定 1 不同的培养基对产孢量的影响 表1 不同的培养基发酵对产孢量的影响 Table 1 Influence of different fermentation mediums on Sporulation quantities 孢子量（个/克） 麸皮 1.4×109 苹果渣 2.1×107 猕猴桃渣 1.3×106 麦杆粉 1.8×102 稻壳粉 1.8×103 花生壳粉 1.2×102 麦壳粉 1.9×103 结果见表1。由表1可见，木霉N-15在麸皮上产孢量最高，其次为苹果渣和猕猴桃渣，花生壳粉最低，故以麸皮和苹果渣混合使用既可降低成本，废物利用, 还可得到较高的生物量。 2.1.2 麸皮与苹果渣的不同配比对产孢量的影响 结果见表2。由表2可见，麸皮与苹果渣比例为3∶2时，产孢量最高，优于单一麸皮培养。 表2 麸皮与苹果渣的不同配比对产孢量的影响 Table 2 Influence of different ratios of wheat bran and apple residue on Conidiations 麸皮 ：苹果渣 孢子量（个/克） 1 ：4 1.9×106 2 ：3 1.2×108 1 ：1 2.1×108 3 ：2 1.9×109 4 ：1 2.0×108 2.1.3 无机盐对产孢量的影响 结果见表3。由表3看出，无机盐的加入可提高产孢量。其原因是，无机盐可缓冲固体发酵中pH的变化，K-和SO42-离子可促进后期菌丝产孢。 表3 无机盐对产孢量的影响 Table 3 Influence of inorganic salt on Sporulation quantities 固料 孢子量（个/克）