CE-SDS与SEC-HPLC比较ppt讲义.ppt

Page : * CE-SDS(非还原）与SEC-HPLC方法比较 报告人：袁梵雨、谢敏、娄昆、陈小龙 CE-SDS(非还原法） 原理简介： 毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。毛細管內先填充凝胶，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离，能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 CE-SDS(非还原） 仪器组成 毛细管电泳系统的基本结构包括进样、填灌/清洗、电流回路、毛细管/温度控制、检测/记录/数据处理等部分。 CE-SDS(非还原） 检测器 CE-SDS(非还原） 进样方式 1. 流体力学进样方式 （1）进样端加压 （2）出口端抽真空 （3）虹吸进样 进样量：毛细管长度的1%-2%；nL级、非常小； 2. 电动进样方式毛细管一端插入样品瓶，加电压。 3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。 CE-SDS(非还原） 工作电压的确定 1、在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压） 2、做电压~电流曲线 3、取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在150~400V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏。 电泳温度的选择 电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制盒分离介质对温度的限制等因素。多数情况下，在20~30℃之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。 各试剂的作用 SDS-MW Sample Buffer： 由于蛋白是两性的，与SDS结合会使蛋白带负电荷，使其在毛细管中往正极方向移动。 内参蛋白溶液：指示迁移时间的变化。 碘乙酰胺：与游离巯基反应，防止其攻击二硫键导致片段增多。 样品处理： 在1.5mL离心管中加入SDS-MW Sample Buffer 50μL，内参蛋白溶液2μL，碘乙酰胺溶液10μL振荡混匀。取供试品溶液（2.5mg/μL）40μL，振荡混匀。将离心管置于70℃水浴加热10min，再次振荡混匀，室温冷却。3000rpm离心60s，取上清液90μL至PCR管中。 CE-SDS(非还原） 2010版中国药典对仪器的一般要求： 毛细管：弹性石英毛细管，内径50μm和75 μm使用较多。根据分离度要求，可选用20cm-100cm长度。 CE-SDS(非还原） 直流高压电源：采用0-30kV（或相近）可调节直流电源，可供应约300 μA电流。具有稳压和稳流两种方式可供选择。 冲洗进样系统：每次进样之前毛细管要用不同溶液冲洗。进样方式有压力进样，负压进样，虹吸进样和电动进样。通过控制压力或电压及时间来控制进样量。 检测系统：将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去2mm一段，使石英壁裸露，毛细管一侧放置一个石英聚光球，使光源聚集在毛细管上，透过毛细管达到光电池。对无光吸收或荧光的溶质的检测，还可采用间接测定法，即在操作缓冲液中加入对光有吸收或荧光的添加剂，在溶质到达检测窗口时出现反方向的峰。 对电泳实验的影响因素 ★ 缓冲液pH：pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介质中离解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和分离灵敏度。 CE-SDS(非还原） 　 高电压 低电压 优点 是实现CE快速、高效的前提，电压升高，样品的迁移加大，分析时间缩短 分离电压越低，分离效果越好 缺点 毛细管中焦耳热增大，基线稳定性降低，灵敏度降低 分析时间延长，峰形变宽，导致分离效率降低 ★ 分离电压： ★ 温度 ：温度影响分离重现性和分离效率。温度升高，缓冲液粘度 降低，分析时间减短，分析效率提高。但温度过高，会引起毛细管柱内 径向温差增大，焦耳热效应增强，柱效降低，分离效率也会降低。 SEC-HPLC 体积排阻色谱(SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。 简介： 分离机理： 固定相是多孔性凝胶，大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被洗脱出来；中等大小的分子能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，在柱中受到滞留，较慢地被洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强的滞留，会更慢地被洗脱出。 图示 仪器： 高效液相色谱仪需定期检定，周期为1年。 SEC-HPLC 2010版中国药典对仪器的一般要求和色谱条件 色谱柱： 多使用凝胶或亲水刚性、多孔微球、机械强度好的聚合物等填充物 使用水或缓冲盐作为流动相，流