显微镜发展史共聚焦.docVIP

共焦显微镜杂记 王义闵 国立中山大学物理系研究生 魏良安 国立中山大学物理系大学生 高甫仁 国立中山大学物理系副教授 一、光学显微镜之发展 光学显微镜自问世以来，已历经了四百年的演变，对于近代科学的发展有极大的影响。其演进的原动力，来自于人们想清楚地看到肉眼无法分辨之微小物体。于十六世纪，光学放大仅靠单一凸透镜完成，但它的制作也导致了显微镜的发展。显微镜历史上有许多著名的人物，但关于第一台显微镜的滥觞，就不得不提到Antony van Leeuwenhoek。他将小玻璃球抛光成一片透镜（放大率约为270倍），并利用此透镜做出世界上第一台实用的显微镜，在他多产的一生，他建造了约四百台的显微镜。由于他只使用单独一片透镜，所以Leeuwenhoek的显微镜被归类为单一透镜显微镜。现今所谓的『光学显微镜』一般指复合式显微镜，是由目镜及物镜所组成。十七世纪时，英国人Robert Hooke即利用自行制作的复合式显微镜发现了生物是由细胞所组成。十九世纪时，显微镜的发展已有长足的进步，并奠立了现今显微镜的规格，例如Carl Zeiss致力于显微镜的制作、Ernst Abbe提出了显微光学原理的理论基础及Otto Schott对光学玻璃详尽的研究。时到今日，显微镜的种类与用途已包罗万象，而显微观测技术也随之增进，较重要且广为使用的显微技术包括暗视野（dark field）、相位对比（phase contrast）、差分干涉（differential interference contrast）、偏光（polarized light）、以及荧光显微术（fluorescence microscopy）等。 二、荧光显微术与生物医学研究的关联 显微术对生物医学发展的影响可谓是空前，但仅凭单纯之空间分辨率并无助于自生物样品撷取太多有用之信息，目前在许多生物样品的观测上，免疫荧光染色（immunofluorescent staining）可说是观测某一特殊蛋白质在局部分布上最具广泛用途和有效的方法。发特定荧光的染料常被『接至』（chemically bonded）一纯化的特殊抗体（antibody）上，而此染料-抗体之复合分子则在样品上寻找相对于此抗体之抗原（antigen）并结合。如此一来，藉荧光显微成像即可显示此一特殊蛋白质的分布与位置（抗体、抗原皆属蛋白质分子）。另一侦测特殊蛋白质的方法即为借助绿荧光蛋白质（Green Fluorescent protein, GFP）。此种蛋白质首在Aequoroa victoria水母上找到，它的分子量为238，在适当的波长激发下可发出绿色荧光。藉重组染色体的技巧（recombinant DNA）可将产生GFP的基因植入活体培养细胞之中，甚至整个生物的某部分细胞之中。如此，带有并表现GFP基因之细胞即可在一片组织中被清楚地标定出来，而GFP蛋白质在细胞中的移动亦可清楚显现。另外荧光影像亦可用于测定细胞质流体（cytosol）中自由钙离子（Ca++）浓度。钙离子在细胞之新陈代谢上扮演极重要之角色，如肌肉之收缩、讯息之传递等。 三、共焦显微镜之发展 由于传统的光学显微镜受到光波绕射的限制，致使它无法提供无限的放大能力，其发展一度被宣告终止，且其成像方式依旧是停留在平面成像。传统上，荧光染色之样品系藉由荧光显微镜观测，但由于景深之关系使得荧光显微镜无法仅观测某一断层，以致拍得之荧光影像常显得一团模糊，无法区分染色的部位到底位于何处，比如在细胞膜上或是细胞内部，所以薄切片的制作技术便应运而生。但切片后则无法观测活体样品，且难以显现样品之原状。这个难题直到共焦扫描显微镜发明后才得以解决。共焦扫描显微的原理，一般咸认在1957年时已由Marvin Minsky提出，如图一.所示，但由于当时缺乏适当的光源与数据处理的能力，使得这一原理仍停留在纯理论之阶段，共焦扫描显微技术能真正 图一. 共焦扫描显微的原理，摘录自Marvin Minsky所提出之美国专利，其编号为3,013,467。 成为一个实用的显微技术则是等到雷射与个人计算机发明以后。在1969年时，Paul Davidovits和M. David Egger利用雷射发展了第一台共焦扫描显微镜，而第一台商业化的共焦扫描显微镜则是到1987年才问世。近十余年来，无论是激光技术或者是个人计算机都有着惊人的发展，使得共焦显微技术更形完备。 单光子共焦显微镜的光学理论首由时在英国牛津大学的Colin Sheppard和Tony Wilson提出。美国康乃尔大学的Watt W. Webb等人则于1989年实验上证实了双光子共焦显微镜的独特性，其设计图如图二.所示，并引起了相当大之震撼。随后Colin Sheppard和Min Gu则提出了相对应之双光子共焦显微镜的