病理技术的新进展.docVIP

病理技术的新进展 放射自显影技术（autoradiograph)是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布与代谢径路，包括定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 其原理是将放射性同位素（如14C和3H）或放射性同位素标记的化合物导入生物体内（注入动物体内或加入培养基中），间隔一定时间取材,制成标本（如切片或涂片），在暗室中涂上液体原子核乳胶（卤化银乳胶），置暗处经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。数日后再经显影、定影处理，或经染色后光镜观察，在放射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原成黑色的微细银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。这种技术与电镜样品处理，则为电镜放射自显影术(electron microscope autoradiography)。 在生物学研究中，常用的放射性同位素主要是能量低、射程短、电离作用强β的射线如3H，14C，32P，35S，125I，45Ca，等或其它化合物。 放射自显影优点：定位精确，灵敏度高，分辨率好，能保存相当长时间；操作简便，无需复杂设备；可供定量研究和双同位素示踪；将形态、机能和代谢地研究统一起来；研究某些大分子在体内地动态变化过程。 原位杂交 原位杂交的概念 原位杂交是用标记的核酸探针与细胞和组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法。即使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。分细胞原位杂交和组织切片原位杂交。 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的，由分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术。 原位杂交的发展简史 ISH始于20世纪60年代。由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。 原位杂交的基本原理 两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子，应用已知碱基序列并具有标记物的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质)RNA或DNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内的待测核酸互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，通过标记物的显示（例如放射自显影等方法），在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。 原位杂交的实践应用 原位杂交技术可在原位研究和检测细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达，进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。随着相继建立的生物素和地高辛等非放射性标记技术，并结合应用免疫组织化学的显示技术，使原位杂交技术迅速推广应用于基础理论研究和临床诊断。如在肝炎病毒，肾综合征出血热病毒，人乳头瘤病毒，结核菌等检测中该法被迅速推广应用。由于其存在的不足，国外用微波加热技术进行改良，在节省杂交时间和蛋白酶K方面取得了良好的效果。 经研究表明，微波加热的原位杂交可以取代普通原位杂交而用于石蜡标本的基因表达检测。目前在国内已逐步开展荧光标记原位杂交技术，能在荧光显微镜下更加简便，清晰地观察结果。 原位杂交的优点和缺点 优点：(1)高特异性及灵敏性：抗原和抗体之间的特异识别及结合的特点，决定了荧光原位杂交的高度特异性，同时使检测的结果具有很高的灵感度；原位杂交技术因其高度的灵敏性和准确性而日益受到许多科研工作者的欢迎，并广泛应用到基因定位、性别鉴定和基因图谱的构建等研究领域。(2)结果直观：其结果在荧光显微镜下可直接观测。 缺点：(1)费时：实验步骤较多，周期长；(2)成本高：蛋白酶K需要量大，所以成本较高。 几种原位杂交技术 　　1、基因组原位杂交技术 　　基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究。 　　2、荧光原位杂交技术 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是20世纪80年代末在已有的放射性原位杂交技术的基础上