离子交换色谱法测定啤酒和鲱鱼精DNA中的碱基和核苷.docVIP

离子交换色谱法测定啤酒和鲱鱼精DNA中的碱基和核苷 摘要：建立了测定啤酒和鲱鱼精DNA中的碱基和核苷的阳离子交换色谱法。采用阳离子交换柱为固定相，以水和pH=2的H2SO4为流动相进行梯度洗脱，次黄嘌呤、鸟苷、胞苷、胞嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤六种核苷和碱基在18min 内获得基线分离，检测方式为UV检测。实验结果显示，六种核苷和碱基的检测限范围为0.009-0.068mg/L (S/N=3).工作曲线的线性范围为0.1-100 mg/L. 峰面积和保留时间的相对标准偏差（RSD）分别在1.34-2.16% 和1.59-3.08%之间，回收率在89.3-107%之间。将该方法用于啤酒和鲱鱼精DNA中的碱基和核苷的分析，获得了满意的结果。 关键词：阳离子交换色谱法，核苷，碱基，啤酒，鲱鱼精DNA 嘌呤和嘧啶碱基是RNA和DNA的结构组成部分，在生命体中对基因信息储存和蛋白质生物合成都起着重要的作用1。核苷关系到中枢神经系统中各种生理过程的调控2。核苷和碱基关系到各种疾病和代谢紊乱生化过程。因此，核苷和碱基分析在生理和医学上是一个重要的课题，已有报道分析了人体液（尿液、血液和脑髓液）和中药（如冬虫夏草）中的核苷和碱基。 近几年，核酸成分的分析也应用到了食品工业领域中。啤酒中核酸的存在是源于发酵期间的酵母活性，这些核苷和碱基成分关系到啤酒的风味，是啤酒新鲜程度的标志之一。另外，啤酒中的核苷和碱基进入人体后最终代谢产物是尿酸，尿酸会导致中风。 虽然液相色谱2、毛细管电泳、胶束电动毛细管电色谱1、离子对色谱和液相色谱质谱联用2等方法均可用于核苷和碱基的分析，但是离子交换色谱应用于核苷和碱基的分析鲜有报道。本文旨在建立简单灵敏的测定啤酒和鲱鱼精DNA中碱基和核苷的阳离子交换色谱法。方法应用于啤酒和鲱鱼精DNA中碱基和核苷的分析，获得了满意的结果。 1实验部分 1.1试剂 次黄嘌呤、鸟苷、胞苷、胞嘧啶、鸟嘌呤，腺嘌呤标准品和鲱鱼精DNA均购于北京拜尔迪生物技术有限公司。燕京啤酒购于北京某超市。实验中所用试剂均为分析级，所有试验用水均为双蒸水。 1.2 离子色谱条件 Agilent 1100 液相色谱仪；阳离子交换色谱柱为 Metrosep C4 150 (150 mm × 4 mm i.d.)；流动相为水（A）和pH=2的H2SO4（B），梯度洗脱程序：0-15min, 0-50% B;流动相流速为 1 ml/min ；紫外检测波长为254nm，进样量为 20 μL。 1.3 样品前处理 啤酒超声30 min脱气后用0.45 μm的滤膜过滤即可进样。称取鲱鱼精DNA 0.02 g 放于密闭的锥形烧瓶，用2 ml甲酸在100℃下酸解1h，然后真空干燥去除甲酸，所得水解产物溶解到100 ml水中，用0.45 μm滤膜过滤后进样。 2结果与讨论 2.1 方法评价 六种核苷和碱基的标准曲线以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制，每个浓度平行测定3次。在0.1~100 mg/L浓度范围内研究了标准曲线的线性。线性相关系数R2在0.9997-1.000之间。检测限为0.009-0.068 mg/L（S/N=3）。结果表明六种核苷和碱基标准曲线线性范围宽、检测灵敏度能满足普通样品分析要求。 在选定的色谱条件下，连续5次重复分析同一个10 mg/L六种混合标准溶液，得到六种核苷和碱基的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）分别在1.34-2.16% 和1.59-3.08%之间，表明此方法具有很好的精密度。 2.2 样品定量分析 所建立的离子色谱方法用于啤酒和鲱鱼精DNA中的碱基和核苷的测定。图2是啤酒样品的分离色谱图。从图1可以看出，六种核苷和碱基均能达到基线分离。 啤酒加标回收实验是在样品提取之前分别加0.02 mg和0.1 mg六种标准品于10 ml 啤酒样品中，鲱鱼精DNA加标回收实验是在样品提取之前分别加0.2 mg和1 mg六种标准品于0.02 g DNA样品中, 然后按照1.3的前处理方法进行提取后，最后进行离子色谱分析。每个加标水平进行三次平行测定，得到啤酒两个加标水平的平均回收率范围分别为94-103.6% 和90-101%,鲱鱼精DNA两个加标水平的平均回收率范围分别为89.3-102.6% 和88.1-99.9%。 图1 10 mg/L六种标准品的色谱图 色谱峰：1=次黄嘌呤、2=鸟苷、3=胞苷、4=胞嘧啶、5=鸟嘌呤、6=腺嘌呤 图2 啤酒样品的色谱图（色谱峰编号同图1） 图3 鲱鱼精DNA样品的色谱图（色谱峰编号同图1） 主要参考文献 1. G. Chen, X. Han, L. Zhang, and J.