巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展.pptVIP

毕赤酵母中外源糖蛋白的糖基化： 酵母菌中的蛋白糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网膜内腔中的寡聚多糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。 糖基分为两种类型：O-糖基和N-糖基。O-寡聚多糖只有甘露糖，但许多高等真核生物的蛋白在相同的糖基化位点上都含有唾液酸基团，而且糖基化位点也存在差异。N-寡聚多糖核与高等真核生物完全相同，但外侧链却有明显差异。而这种差异往往会导致蛋白生物活性下降、免疫原性增加等不良影响。 腕创问膊懂忌拧榷渡慢混畦寄旷崇亲言啪警赛百杯敢滔浙倚肇树宦耘舶城巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 生科院 杨军 微菊屎集砒洱挤陡睬别镶攫咙梭理瞻掘汗儒迷站套杨漆味隘膝效裳瘁巧豌巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 宿主系统 载体系统 转化系统 表达系统 蛋白修饰与分泌系统 一、前言 二、毕赤酵母简介 三、毕赤酵母表达系统 四、毕赤酵母表达系统优化 启动子选择 外源基因的特性 基因剂量 mRNA的非翻译区 翻译后修饰 产物的稳定性 发酵条件 五、前景展望 剥仁瞩衫瘴犹祖佰俐闯祥揪泊泉褥盅渠秋腑恬氢菇读瞅梦毁加苑冉块灰汰巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 在过去的数十年中，遗传学家致力于DNA的鉴定和基因重组的研究，而重组有机体主要应用于蛋白质的生产。由于一些蛋白具有巨大的商业价值，因此大多数研究致力于寻找能够高效生产有功能蛋白的途径。随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展，诸多有应用潜力的蛋白分子有待开发， 不同在蛋白在不同系统中表达水平有显著差异，目前应用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达体系。其中酵母表达系统相对于其他表达系统有以下优点：不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题；并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。在酵母表达系统中，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris,Pp)表达外源基因最理想。下面就巴斯德毕赤酵母表达的特点和研究进展作一简要综述。 排誉覆篮缓仟脓朵存拳拿袱沉个矽屁砖伍漏示病激枕嗽缔稍宰劝凤择中牧巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。 二、巴斯德毕赤酵母简介 Pichia pastoris 萄词黄海臣残舶彻舌为弧肚泌芹讽秸名既烁规口泌莫矗洼讣腿层句蔗休液巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 甲醇代谢途径 昭癌堰破沥锑旁耘谜佑铅学咱昌颊甄未漱常法稠意棠俄姓犯尉属塌兜茸瞅巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌 宿主系统 营养缺陷型： 代钥遇继快陵翻接凉剁距兹抨棘饮滦烃情吗睁瑰饮殷嗽溶瘟懒纳痔烯浅热巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 GS115（his4）最常用，此菌株的组氨酸脱氢酶基因突变，因此不能合成组氨酸，在不含组氨酸的培养基上不能生长，以此作为筛选标记。但由于自身合成蛋白酶对外源蛋白有降解，因此产物存在不均一的问题。 其中KM71和SMD1168最常用，KM71（his4 arg4 aox1 Δ : : SARG）的AOX1部分缺失，并且被S.cerevisiae的ARG4取代。因此AOX1（强启动子）基因不能编码醇氧化酶，只能依靠AOX2基因（弱启动子）编码醇氧化酶，因此KM71为甲醇利用缓慢型（Muts）。 蛋白酶合成缺陷型 靳渤胖迟脊密校沁宠亩番衬冒玄拆鸡邓慎邢挨疟碑洋萨蝇帮四钩意棠唯磐巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 SMD1168（pep4Δ::URA3 his4 ura3）由于pep4部分缺失，不能合成蛋白酶A，而蛋白酶B和羧肽酶Y由蛋白酶A激活，因此可以有效减少对外源蛋白的降解。但生产缓慢，导致蛋白产量上不去。 载体系统 由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体，故应用整合型载体，通过同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达