组织工程实验讲义.docVIP

校内讲义 组织工程实验 （供药学院生物工程专业用） 吉林大学药学院生物工程综合教研室 二○○五 实 验 须 知 1．按时进入实验室，穿好白大衣，带好实验纪录本和笔； 2．实验前应认真做好预习，明确本次实验的目的，了解实验内容，熟悉实验步骤； 3．实验前认真听任课教师的讲解和实验安排，未经允许勿动任何实验器具； 4．实验中不要大声喧哗，如有问题，及时请教任课教师，做到有条不紊； 5．认真按照实验操作规程进行实验，及时准确地做好实验记录； 6．实验记录要采用专用实验记录用纸，不得用单页纸进行记录； 7．实验记录要使用钢笔或碳素笔，不得使用铅笔、圆珠笔进行记录； 8．不得涂沫、删改原始实验数据，养成实事求是和严谨的科研作风； 9．对实验中涉及到的精密仪器，要严格按照使用规程进行操作，出现故障或有不明之处，要及时请教任课老师，不得擅自拆卸维修； 10．实验废弃物要按相关要求进行统一收集处理，不得随意倾倒； 11．实验结束后，要认真清洗实验器具，并按要求摆放，清洁实验台面； 12．值日生认真清扫地面，清理实验垃圾； 13．离开实验室前，要认真检查水、电、煤气是否关闭好，养成良好习惯； 14．实验后要及时写出实验报告，按时交给任课教师评阅。 前 言 本《组织工程实验》讲义是根据药学院生物工程专业（医学）教学需要，遵照教学大纲要求而编写的。 本实验讲义编写的指导思想是： 1．根据《组织工程》理论课程内容，确定实验课内容； 2．结合学院现有实验设备和实验条件，确定实验内容； 3．与其它相关实验课内容统筹考虑，确定实验内容； 4．根据本专业学生的实际情况，培养学生的独立实验能力； 5．充分考虑到本专业的学科发展和技术前沿； 6．参考兄弟院校相关专业的实验课程开设情况。 通过本实验课的教学实践，使学生加深理解理论课学习的内容，掌握组织工程基本的实验技术和操作规程，达到独立开展组织工程实验的能力。 本《组织工程实验》讲义是由生物工程综合教研室和生物工程实验中心全体教师共同努力完成的。由于编写时间仓促，编者水平有限，教学经验不足，对于文中存在的错误和纰漏之处，恳请各位老师和同学批评斧正。 2005年11月  目 录 实验一 骨髓间充质干细胞的分离培养……………………… 4 实验二 软骨细胞的分离培养………………………………… 7 实验三 大鼠神经胶质细胞的分离培养……………………… 11 实验四 鼠尾胶原的制备……………………………………… 16 实验五 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平检测………… 18  实验一 骨髓间充质干细胞的分离培养 【实验目的】 1．掌握骨髓取材的基本方法。 2．掌握分离骨髓间充质干细胞（MSC）的方法。 【实验原理】 利用密度梯度离心法，将骨髓中的各种细胞分层，分离出骨髓间充质干细胞。 【实验材料】 1．动物：4周龄新西兰大白兔戊巴比妥钠3%）：戊巴比妥钠0.15mol/L的 NaCl备用，密度为1.073g/ml。 5．MSC培养液的组成：含有10%胎牛血清，2mmol/L左旋谷氨酰胺、100μg/ml 青霉素钠、100U/ml硫酸链霉素的低糖DMEM培养液。 6．无Ca2+、Mg2+ 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：NaCl 0.8g、KCl 0.2g、Na2HPO4?12H2O 2.9g、KH2PO4 0.2g，二次蒸馏水溶解，调pH至7.0～7.2，定容为1000ml。高压灭菌后，4℃冰箱保存。 7．白细胞稀释液的组成：无水乙酸2ml，1%龙胆紫1ml，蒸馏水97ml，混匀备用。 8．苔盼蓝（0.4%）：苔盼蓝0.4g，溶于100ml生理盐水中，搅拌10min左右，过滤，室温保存。 【实验步骤】 1．抽取骨髓：3%戊巴比妥钠按50mg/kg体重的剂量行腹腔注射麻醉。无菌条件下，暴露左右两侧胫骨表面的近中端。用一支固定有18号针头内含0.1ml肝素（3000U/ml）的5ml注射器从骨髓中抽取2ml骨髓液。5%CO2、饱和湿度下培养。 11．48小时后，有少量细胞贴壁，呈纺锤形。吸去上清，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞表面3次，将未贴壁细胞弃去。 12．7天左右出现克隆，14天出现致密贴