细胞生物学综合实验报告.docVIP

本科学生实验报告 姓名 学院＿生命科学学院＿ 专业＿ 班级＿10B班＿ 实验课程名称＿人类淋巴细胞株的培养＿ 指导教师及职称 许琳峰 ＿ 开课时间 2012 至＿2013 学年＿上 学期 云南师范大学教务处编印 实验名称： 人类淋巴细胞株的培养 实验时间： 2012.3——2012.4 实验室： 睿智楼3栋424 小组合作： 第四小组 实验主要内容： 1、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌） 2、培养基的配制 3、细胞传代培养 4、死活细胞的鉴别 一、实验目的 1、能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 2、熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。 3、熟练掌握细胞传代培养的操作方法，观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。 4、掌握死活细胞的鉴别原理及方法。 二、实验原理 1、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌） (1)、清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。 (2)、体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。 (3)、灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。 培养基的配制 细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。 细胞传代培养 当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定的密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比例转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。 4、死活细胞的鉴别 细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。 原理：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。 实验大体流程 细胞培养准备工作 培养基的配制 细胞传代培养 死活细胞的鉴别 装置示意图 实验仪器，材料及试剂 工具 超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器 细胞培养瓶、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器（0.22μm）及注射器、离心管 微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、光学显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、血球计数板、滴管、显微镜、 血球计数板 材料 微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um、各种规格的Tip 、培养细胞、人类淋巴细胞株。 试剂 75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl、 酚红、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、NaHCO3 、L-谷氨酰胺、三蒸水 台盼蓝（染料）、乙醇 ：0.4%台盼蓝溶液 六、实验步骤 清洗 胶塞处理 塑料制品的清洗 tip和tube的清洗 洗液的配制 消毒和灭菌 化学消毒法 准备（清洗与灭菌） 合成培养基的配制 小牛血清的处理 生长培养基的配制 每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基 没人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内 然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液 放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖（直立放置 ）