western blot失败经验总结供参习.docVIP

western?blot失败经验总结1我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。 western?blot失败经验总结2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。ＷＥＳＴＥＲＮ?ＢＬＯＴＴＩＮＧ心得 １．??总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）： 组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.（2）离心机 1000rpm，4 离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4 离心 1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可 )。沉淀用适量的 Buffer B重悬，4度过夜后，分装至 EP管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4 离心 30min。（4）收集所得上清液即为膜组份。Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4度保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度：考马斯亮兰Ｇ２５０配方：G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至2000ml,过滤后使用。BSA标准液：0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。配制标准液(浓度分别为0，10，20，30，40，50ug/ul)：??1??2??3??4??53??6G250??3ml??3ml??3ml??3ml??3ml??3ml0.5mg/ml BSA????20ul??40ul??60ul??80ul??100ulddH2O??100ul??80ul??60ul??40ul??20ul??待测蛋白配液：每管3ml G250，2ul样品，98ul ddH2O。（若加入样品后，液体没有变蓝色，则可再加2ul样品，ddH2O减为96 ul，标准液浓度可适当扩大。）