细菌细胞DNA中碱基成分的高效液相色谱测定法的研究.docVIP

细菌细胞DNA中碱基成分的高效液相色谱测定法的研究 ??? 作者：向仲朝 邓明林 岳蕴瑶等 来源：INTERNET 摘要：【摘要】 目的 建立细菌细胞DNA中碱基成分的高效液相色谱定量测定方法。 结果 优选细胞DNA中碱基成分测定的最佳实验条件，建立简便、快速、灵敏、精密度好、准确度高、抗干扰能力强的高效液相色谱测定方法。 结论 本法可用于细菌细胞DNA中碱基成分的测定。 高效液相色谱法测定细胞DNA中的碱基成分，有着广泛的应用前景，可... 临床快报 药市动态 违法医疗广告 医疗保险 药品价格 药品回收 保健常识 妇科课堂 饮食与健康 全文:??? 【摘要】 目的? 建立细菌细胞DNA中碱基成分的高效液相色谱定量测定方法。 方法? 对其实验条件，如检测波长、流动相、方法的线性范围及最低检出量、精密度和准确度等方面进行实验研究。 结果? 优选细胞DNA中碱基成分测定的最佳实验条件，建立简便、快速、灵敏、精密度好、准确度高、抗干扰能力强的高效液相色谱测定方法。 结论? 本法可用于细菌细胞DNA中碱基成分的测定。 ??? ??? 高效液相色谱法测定细胞DNA中的碱基成分，有着广泛的应用前景，可用于细菌、病毒、真菌等微生物的核酸研究。它能对表型特性相似，临床生化反应相同，难以鉴别的细菌，尤其是对一个新菌种作出辅助鉴定 ［1］ 。本文对高效液相色谱测定DNA中碱基成分鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）的方法进行了研究，对部分细菌细胞DNA中的碱基成分进行了测定，现报告如下。 ??? 1 实验部分 ??? 1.1 仪器及工作参数 HP1100LC液相色谱仪，HP chemsta-tion色谱数据工作站，UV—可见紫外检测器，在线脱气;色谱柱:ODS C 18 Hypersil5μm250×4mm;流动相:甲醇（A）+0.02mol/L乙酸铵（B），梯度洗脱，见表1;检测波长254nm;柱温:室温;流速:1.0ml/min;进样量20μl。 ??? 表1 梯度洗脱（略）???? 1.2 试剂 甲醇:经滤膜（0.45μm）过滤;0.02mol/l乙酸铵溶液称1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000ml，经滤膜（0.45μm）过滤;鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）标准溶液:各称50.0mg，加磷酸2.5ml，加10ml水，加热至80℃溶解并用水稀至50.0ml，即成1.00mg/ml混合储备液。 ??? 1.3 细菌DNA游离碱基的制备 ［2，3］ 及测定 取分离、纯化的菌株适量，经溶解、沉淀蛋白等，抽提出DNA，按干品约0.5mg（湿品约50mg）加72%高氯酸1.0ml，完全溶解后，在沸水溶中水解40min，冷却后，用水稀释2倍测定。 ??? 1.4 标准的测定 取鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）各为1.00mg/ml标准混合储备液稀释成0.010mg/ml和0.10mg/ml标准应用液。取0.010mg/ml标准应用液0，1.00，5.00，10.0ml以及0.10mg/ml标准应用液5.00，10.0ml，加水至10.0ml，配成鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）各为0，1.00，5.00，10.0，50.0，100（μg/ml）标准系列，进样20ul测定。 ??? 2 结果分析及讨论 ??? 2.1 检测波长的选择 经实验:鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）最大吸收波长在254nm左右，本文选用254nm为测定波长。 ??? 2.2 流动相的选择 选用甲醇和0.02mol/L乙酸铵溶液作流动相，按表1梯度洗脱，可以完成细菌DNA碱基的完全分离。 ??? 2.3 分离效果 从100ug/ml混合碱基标准的色谱图（图1）可知，鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）在254nm测定，可完全分离。胞嘧啶（C）（tR=3.471）、鸟嘌呤（G）（tR=5.390）、胸腺嘧啶（T）（tR=6.072）、腺嘌呤（A）（tR=8.495）。图2为4号细菌的DNA碱基成分的分离图。从图2可以看出，胞嘧啶和腺嘌呤出峰稍有延后现象。 ??? 2.4 线性范围与最低检出浓度 胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A））在0～100μg/ml范围内，浓度C与峰面积（Area）呈直线相关关系。方法的线性范围、最低检出浓度见表1、表2。 ??? 表1 标准系列测定值 （浓度μg/ml-峰面积）（略） ??? 2.5 方法的精密度和准确度 对样品中胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A））进行了6次测定，结果见表3、表4。 ??? 表3 方法的精密度（略） ??? 测定值