肝糖原的提取鉴定与定量.doc

生物化学实验报告 姓 名： XXX 学 号： 23333333333 专业年级： 2012级临床医学 组 别： 第3实验室 生物化学实验教学中心 实验名称 实验日期 3-12-30 实验地点 9实验室 合作者 XXX指导老师 X 评分 教师签名 批改日期 CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O 2CuOH = H20 + Cu2O (红色) Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色) 肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。 实验材料 仪器： 普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平 剪刀、镊子、研钵 试管架，离心管，试管 刻度吸量管（2ml ,5ml），1000μl微量可调取液器 100ml容量瓶 白瓷反应板 试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L） 蒽酮显色剂 实验步骤 肝糖原的提取 鸡肝约1.5g，剪碎 研磨至乳状 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3min（4000r/min） 取上清液 离心5min（4000r/min） 取沉淀 沸水浴2min，溶解沉淀 糖原溶液1ml 白瓷板中 沸水浴加热15min，冷却 加碘试剂0.1ml 加碘试剂0.1ml 糖原溶液0.1ml 糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液 呈色对比 混匀 沸水浴2min，观察变化 注意事项： 提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4ml多，加上等量乙醇，总量接近9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。 糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定 鸡肝 0.15 g 沸水浴15min 冷却，全部转入100ml容量瓶中 加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液 取3支干净的试管，按下表操作： 试剂（ml） 空白管 标准管 样品管 蒸馏水 1.0 —— —— 标准葡萄糖溶液 —— 1.0 —— 糖原提取液 —— —— 1.0 0.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5 混匀，沸水浴10min，冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空 白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算： 肝糖原（g/100g肝组织）= X 0.05 X X X 1.11 实验现象与结果讨论 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，但与碘试剂原来颜色区别不大。 鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色，下层无色。 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比 将空白管在620nm处的A值设定为0，测得标准管、样品管的A值如下： 空白管 标准管 样品管 1 0 0.610 0.085 2 0 0.612 0.085 3 0 0.616 0.091 平均值 0 0.613 0.087 肝糖原（g/100g肝组织）= X 0.0