第十一章荧光分析法.pptVIP

§1 荧光分析法基本原理 一、分子荧光 （一）、分子荧光的产生 分子在辐射能的照射下，电子跃迁至单重激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级，由此再跃回基态或基态中其它振动能级时所发出的光。 基态和激发态 单重态和三重态 辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热） 激发单重态S与激发三重态T的不同点： 1.能量高 2.激发单重态平均寿命短， tS = 10-8s, 3.基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁 1.能量低 2.激发三重态平均寿命长， tS = 10-4-- 1s, 3.基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁 （一）、荧光效率（ fluorescence efficiency）? 三、影响荧光强度的外部因素 A、温度影响 温度上升，荧光减弱 B、溶剂的影响 增大溶剂的极性使荧光增强 含重原子的溶剂（e.g. CBr4）使荧光减弱 溶剂粘度降低荧光强度减弱 C、酸度的影响 D、荧光熄灭剂 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失。 E、散射光 §2 荧光定量分析方法 二、定量分析法 F = ?K （I0-I）= K’（I0-I） =K’（1-10ECL）=K’（1-e2.3ECL） =2.3K’I0ECL =KC ECL0.05 当浓度较浓时，吸光度ECL0.05时， 荧光强度同浓度的线性关系将向浓度轴偏离。 分光法与荧光法定量比较 UV-VIS分光法 荧光法 定量基础 A = lgI0/I F ? C 灵敏度 与 ? 有关 与 ?? 有关 检测限 10-6-10-9 10-9-10-12 灵敏度高选择性好 1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞， 常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器 闪耀光栅 ? 3 检测器 光电倍增管 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？ 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？ 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。 4. 荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是( ). A.激发光; B.磷光; C.拉曼光; D.容器表面产生的散射光 5． 测量荧光强度时,要在与入射光成直角的方向测量,这是因为 ( ). A.只有在与入射光成直角的方向上才有荧光; B.在成直角方向测量可以避免散射光的影响; C.在成直角方向测量可免除透射光的影响; D.荧光的强度比入射光强 6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。 7. 荧光光谱的特征？ 1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光( )。 A. 波长长的光线 B. 波长短的光线 C. 能量大的光线 D. 频率高的光线 2. 下列说法正确的是( ) A 荧光发射波长永远大于激发波长 B 荧光发射波长永远小于激发波长 C 荧光光谱形状与激发波长无关 D 荧光光谱形状与激发波长有关 3．荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是( ) A. 单色光 B. ECl≤0.05 C. 入射光强度I0一定 D. 样品池厚度一定 判断题 1．荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相同的荧光光谱。 2．荧光光谱的形状与激发光谱的形状常形成镜像对称。 3．在一定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。即： 4.荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光光谱。 5．荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光 路为一条直线。 未经任何处理即可用于细胞标记 用量子点检测肿瘤细胞 泰勒级数展开 即 吸收的强度 入射的 出射的 A=kbc 定量关系 通常 A0.05 If与A 的关系 A与c正比，低浓度 泰勒级数展开，仅取一项， x越小越符合 定量