试验方案(草案).docVIP

二、研究方案 （一）试验方案 研究一 玉米根系、叶片蛋白质组双向电泳技术体系的建立与优化 研究目的 通过采用不同蛋白裂解液配方进行玉米根系、叶片的双向电泳，比较各种方法跑胶的效果，选择最佳的提取方法，建立符合该组织和系统的双向电泳技术体系。 研究内容 试验方案 （1）、供试材料：耐淹型浚单20（XD20）或敏感型登海662（DH662） （2）、试验设计：随机区组试验设计，4次重复。在人工气候室进行培养，正常条件下培养，在两叶一心期取其根系、叶片，置于-80(C下保存，备用。 （3）、取样：取样时，将根系在流水下清洗干净后，将整个根系和叶片取下，备用，如不立即使用，置于-80(C保存。提取时，将所取根系、叶片分别混合，液氮研磨后平均分为三份。 （4）、操作方法： 蛋白质的提取方法 A、TCA-丙酮沉淀法法(TCA／acetone extraction) 参考Damerval的方法，略作改动 使用之前将一份丙酮在-20(C下放置至少15分钟；每份样本大约需2mL丙酮，确认样本管是采用丙酮耐受材料制成； 精确测量每份样本的体积，将每份样本分装入2个离心管中，每个管中4倍样本体积的预冷丙酮（含10%三氯乙酸，和0.1%DTT）； 在-20(C下沉淀蛋白质至少2小时； 在2-8(C下以大约13000xg的离心力（小型微离心设备，13000rmp）将蛋白质离心10分钟（将离心管按照公认位置置于离心设备中，盖冲外，有利于检测小蛋白质沉淀）； 轻轻倒出丙酮，不要搅散离心沉淀，可采用干净的吸水纸小心将丙酮液滴从沉淀上吸去； 风干沉淀（一般在室温下5-10分钟），不要过度干燥（注意如果过度干燥，再溶解就会很困难）； 用合适的缓冲液将沉淀样本再溶解； 如果不立即使用，可储存于-20(C或-70(C条件下。 B酚提取法(TCA／acetone／phenol extraction) 1）、取新鲜玉米组织2 g，液氮中迅速研磨成细粉； 2）、加入1.5倍苯酚和1.5倍的苯酚提取液，5000rpm离心10min，收集上清液； 3）、再加入1倍体积的酚提取液，再次5000rpm离心10min，收集上清液； 4）、加入0.2倍体积的甲醇，-70(C冰箱保存过夜； 5）、离心、清洗沉淀，用200μl的甲醇缓冲液（内含0.1M NH4AC，1%β-Me）,离心去上清液； 6）、重复上述5步骤，往沉淀中加入80%丙酮200μl，离心沉淀保存在-4(C中待用。 *C聚乙二醇沉淀法（备用，不做详细介绍） 1）、精确测量每份样本的体积，将每份样本分装入2个离心管中，取100～150ml 50% PEG溶液加入到100ml蛋白样品中，缓慢搅拌60min，至完全沉淀，然后离心收集蛋白质沉淀。 2）、风干沉淀（一般在室温下5-10分钟），不要过度干燥（注意如果过度干燥，再溶解就会很困难）。 裂解液配方： A、8M尿素（可增至9M或9.8M），1%（m/v）DTT，2%～4%（m/v）CHAPS，2%（v/v）两性电解质（pH3～10）,10M Pefabloc蛋白酶抑制剂。 B、7M尿素，2M硫脲，1%（m/v）DTT，2%～4%（m/v）CHAPS,2%(v/v)两性电解质（pH3～10），10M Pefabloc蛋白酶抑制剂。 根系蛋白质提取方法： TCA-丙酮沉淀法与配方A 苯酚提取法与配方A TCA-丙酮沉淀法与配方A 苯酚提取法与配方A 聚乙二醇沉淀法与配方A 叶片蛋白质提取方法： 1）、TCA-丙酮沉淀法与配方A 2）、TCA-丙酮沉淀法与配方B 3）、苯酚提取法与配方A 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度测定采用Bradford法， 1）、试剂： ① 标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 ② 考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2器材： ① 可见光分光光度计 ② 旋涡混合器 ③ 试管16支 操作方法 1标准方法 ① 取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 ② 加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，