【2017年整理】猪胚胎体外培养影响因素的研究.docVIP

猪胚胎体外培养影响因素的研究综述 摘要： 本研究以孤雌激活胚胎为研究对象，对猪胚胎体外培养过程中的相关影响因素进行了探讨。体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后，用添加.05%BSA的NCSU一23培养的囊胚率(36.7%)极显著高于添加5%，10%和15%FCS的NCSU一23(11.8%，18.5%和10.3%，P0.01)。在NCSU一23中添加一定比例的TCM一199(10%，25%和50%)，虽然对猪卯母细胞孤雌激活后的分裂率无显著影响(89.6%vs87.0%，83.4%和82.6%，P0.05)，但囊胚发育率随着TCM199比例的增加而显著下降(30.1%vs25.0%，11.1%和1.1%， P0.05)。将NCSU23中的亚牛磺酸浓度从原来的5mmo比降低到.25，1.0或.05mmol几时，对猪卵母细胞激活后的分裂率和囊胚发育率均无显著影响(介.005)，但完全去掉亚牛磺酸则导致囊胚发育率极显著下降(l.4%)。在猪卵母细胞激活后的0币oh添加.034mmol几丙酮酸钠和.54mmol几乳酸钠，显著提高卵母细胞的分裂率(71.0%vs63.9%，P0.05)，但60h后在培养液中添加丙酮酸钠和乳酸钠则极显著降低其囊胚发育率(3.0，.63，.33%vs20.2%，P.001)。从胚胎培养开始就添加葡萄糖可提高胚胎的囊胚发育率(20.1%vs10.3%，P0.05)。在NCSU一23中添加12mmoUL的山梨醉，孤雌激活胚胎的囊胚发育率有所提高(32.4%vs26.0%)，但差异不显著(产司.1875)。 以上结果表明:(1)BSA的猪胚胎体外培养效果优于FCS;(2)猪胚胎的体外培养不需要成分复杂的培养液;(3)亚牛磺酸是猪胚胎培养液必不可少的重要成分，但其浓度可下调到现行的1/10;(4)乳酸盐和丙酮酸盐对猪胚胎的早期发育有促进作用，但不利于后期发育;葡萄糖对猪胚胎的整个培养发育过程均有促进作用。(5)山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有促进作用，但其效果有待进一步验证。 关键词: 猪胚胎；体外培养；分裂率；囊胚率 1 前言 人们致力于猪胚胎体外生产的研究至少超过了30年且在不断的发展与进步中[ 1- 3]。长期以来, 大量的研究试图通过改善培养系统来提高体外胚胎生产 效率, 努力提高整个生产系统各个环节的技术水平[ 2 , 4- 5], 然而进展不大, 目前猪体外成熟 ( I VM ) /体外受精 ( IVF) /体外培养 ( I VC ) 的总体效率仍然较低。卵子的体外成熟和胚胎培养是这一技术的重要环节, 提高这些环节的技术水平对提高整个体外生产体系的效率尤为重要。因此, 本研究拟以猪孤雌激活胚胎为研究对象, 着重探讨猪胚胎体外培养过程的相关影响因素, 以便建立一套有效的猪胚胎体外培养系统。 2 材料与方法 2 .1 试剂及药品 TCM - 199, Gibco公司生产;犊牛血清 ( FCS) ,Hycl one公司生产;人绒毛膜促性腺激素 ( hCG) ,宁波激素制品厂生产。除特别注明外 ,其他所有无机盐和生物化学试剂均为 Sigma公司生产。卵巢保存及运输液:含有 K+、 Ca2 +、 Mg2 +的生理盐水。洗卵液: TCM - 199 + 2%发情牛血清 (OCS)。成熟液: NCSU - 23基础液 + 10%卵泡液 ( PPF) +半胱胺酸 +激素。胚胎培养液: NCSU - 23基础液 +0 . 5%牛血清白蛋白 (BSA)。以上配制的所有试剂均用孔径为 0 . 22μm的微孔滤膜过滤消毒。 2 .2 卵母细胞的采集与成熟培养 从屠宰场收集青年母猪卵巢 ,将其置于含有30～35 ℃生理盐水的保温瓶内 ,在短时间内送回实验室;然后用 10 mL注射器和 12号针头穿刺抽吸卵巢上面 3～8 mm卵泡内的卵母细胞 ,在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层或部分致密卵丘细胞的卵母细胞 ,用洗卵液清洗 2次 ,放入已装有 1 . 5 mL含有激素 (10 U /mL hCG, 0 . 1μg/mL FSH)的成熟培养液 (无血清的 NCS U - 23基础液 + 10% PFF +10 ng/mL EGF + 0 . 1 mg/mL半胱胺酸 )的玻璃培养皿 (每皿 200～300枚 )中 ,在 38 . 5 ℃、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中体外成熟培养 20～22 h,然后转移到不含激素的成熟液中再培养 22～24 h。 2.3 血清的制备 用无菌针头和离心管在发情当天的母牛颈静脉处采血 ,静置 30 min;在 4 ℃冰箱中放置 24 h左右 ,待血清全部析出后 ,以 3 500 r /min离心 10 min;吸取血清 ,再以同一转速离心 10 min;弃去沉淀 ,将血清在56 ℃