植物花药和花粉培养-.pptVIP

（三）花粉发育时期 小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。 四分体: 醋酸洋红染色 四分体: Alexander’s 染色 单核期 双核期 成熟花粉粒 处于不同发育时期的烟草小孢子 单核晚期 ?液泡 第一次有丝分裂后期 双核早期 双核中期 ?生殖核 ?生殖核 营养核? 一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。 形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体。 ? 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 发育时期 物种 减数分裂期 草莓、番茄 四分孢子期 葡萄 单核早中期 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 单核晚期 荔枝、茄子、青椒、小麦 单核早期至晚期 烟草 单核早期至双核期 梨、水稻、甘蓝 四分孢子期至双核期 玉米 对不同发育阶段的花药进行培养测试 确定最佳小孢子发育时期的形态特征 注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化 处于不同发育阶段的烟草花芽 花粉发育时期的确定 （四）预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。 1、高低温处理 低温预处理：指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在1-14℃，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。 例子:小麦穗子培养前4℃预处理几天，花药培养效率显著提高。 十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9℃处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个。  预处理方法： 高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35℃）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。 例子:如烟草，32℃高温；小麦，33℃高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996） 2、化学物质处理 包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。 3、其它 包括γ射线、离心、磁场等。 （五）培养基 1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。如H培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马铃署-Ⅱ培养基（适于马铃署） 2.碳源 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。 3、激素 4、氨基酸 5、活性碳 6、pH （六）培养条件 1、温度 物种间有差异 2、光照 3、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。5×103到2×104／ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。 （七）花药壁因素 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。 单倍体植株鉴定和染色体加倍 一、倍性鉴定 （为什么要进行倍性鉴定？） 1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。 2、间接鉴定 （1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 （3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。 （4）杂交鉴定法 自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （5）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等） 二、染色体加倍 （为什么要进行加倍？） （一）茎段培养 将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。 二、染色体加倍 （为什么要进行加倍？） （二）化学试剂诱变 有秋水仙素、Oryz