【2017年整理】来自人类排泄物中的新属新种-Subdoligranulum variabile.docVIP

来自人类排泄物中的新属新种-Subdoligranulum variabile 摘要 在研究人类排泄物中的菌群时，我们分离出了一个菌种，这个菌种是严格的厌氧的，无芽孢，革兰氏染色为阴性并且呈现多样性的球菌形态。从系统发育看，相对的16S核糖体RNA基因序列研究表明未知的菌群是柔嫩梭菌亚属rRNA簇的一个成员。并且与来自人类和猪的排泄物的一些rDNA表现了密切的关系。和这种已分离未知菌体关系最近的已命名的菌体是Faecalibacterium prausnitzii (以前的Fusobacterium prausnitzii)，并且与Faecalibacterium prausnitzii的16sRNA序列表现出接近9%的分离比，Anaerofilum agile 和 A. pentosovorans与未知的菌体表现了第二亲密的关系（序列分离率接近10%）。基于表型和系统发育的考虑，这个不寻常的球状菌体被归类为一个新的属和种- Subdoligranulum variabile。这个模式菌株S.variabile叫做BIT (=CCUG 47106T=DSM 15176T)。 简介 相对小亚族16S rRNA的系统发育分析改变了我们对于人类肠道微生物多样性的认识。尽管长期以来我们认为人类胃肠道是由大量的多样性厌氧细菌构成的，但是随着独立培养研究的到来，尤其是16S rDNA群落的分析，这种多样性的范围才开始被揭露（例如[1,2]）。这和其它的一些研究表明：很大一部分的菌种迄今为止还未被分类学所描述[1-3]。尽管可能是由于许多的这样“隐蔽物种”是不可培养的，但是更可能是由于要把一些其它的菌种描述成特征明显的实体是困难的，因而在过去逃避了描述。16S rRNA基因序列分析正被看做一种从环境中筛选潜在的新奇的物种多样性的有力工具。的确，最近几年，同时利用这种分子诊断工具和培养方法已经导致了来自人类排泄物许多新颖的菌种的描述[例如，4-8]。在人类肠道微生物多样性研究的进程中，我们已经利用了前面提到的方法来帮助迄今为止未知菌种的鉴定。这种未知菌种属于Clostridium leptum rRNA亚属簇之内。基于目前的研究发现，我们描述了一个新的属和种- Subdoligranulum variabile。 材料和方法 2.1培养和生化特点 从住在Hφrsholm, Denmark47岁的女性排泄物样品中得到菌株BI114T。该菌株是从市场上买的Biolog Universal Anaerobe琼脂培养基上分离的，该培养基中添加了体积比例为5%的去纤维蛋白的小牛血液（简称BUA+B）(Biolog Inc., Hayward, CA, USA)，然后在37℃，N2, CO2 和 H2体积比为80:10:10%的气相条件下进行厌氧培养。该菌株也能在根据Barcenilla等人的文献所记录的那样准备的液体培养基M2GSC（包含瘤胃液）中生长，在含有煮熟的肉颗粒的Fastidious Anaerobe液体培养基中也能生长。生长情况可以在37℃一周内每隔两天检测一次，检测时分别在需氧，微量需氧(含体积比为2%和6%氧气)，绝氧条件下进行。 根据Holdeman[10]等人文献中所记录的那样，对发酵产物通过气液色谱法进行分析。对该菌株进行传统的生化检测[10,11]，并且该菌株可以在厂家指示的情况下，利用AN-MicroLog TM 系统(Biolog Inc., Hayward, CA, USA)和API ZYM 与Rapid ID 32A 系统 (API bioMerieux, Marcy l’Etoile, France)进行生化特征鉴定。 2.2 生化分类特征 提取长链细胞脂肪酸，然后利用Miller[13]修改方案进行甲基化[12]，再利用MIDI系统进行分析(MIDI, Newark, DE, USA)。在一种压力感受装置下对细胞进行破坏，然后进行DNA的分离，通过羟磷灰石层析而纯化。根据Mesbah[14]等人记录的那样用P1核酸酶和碱性磷酸酶对DNA酶解，之后利用高效液相色谱进行G+C摩尔百分含量的测定。 2.3 系统发育特点 利用通用引物pA(positions 8 to 28,Escherichia coli numbering) 和pH* (positions 1542 to 1522)对分离菌株的16SrRNA基因进行PCR扩增。用QIAquick PCR purification试剂盒(Quiagen Ltd., Dorking,UK)对扩增产物进行纯化，然后利用直接指向rRNA基因保守序列的引物以及dRhodamine终止子循环序列试剂盒(PE Applied Biosystems, Inc., Foster City