以间接计数法计算总菌数的测定.docVIP

直接計數法計算總菌數的測定 (血球計數法) 目的 讓我們學習如何運用血球計數器與其計算方法；在顯微鏡下，利用不同倍數的物鏡進行直接觀察，計算出觀察到細菌的總數量；直接計數的目的為計數並非觀察，所以只需能辦別出菌體即可。 二、原理 利用各種不同的計數器或載玻片，在顯微鏡底下直接觀察，並計算微生物細胞的總數量。 血球計數器為直接計數法中最常用的方法，計數器上凹處有一邊長1mm的正方形格子，該格內分為25個方格(5×5)，每一個大方格再細分為16個小方格(4×4)，因此，每小格的邊常為0.05mm，在高度方面，蓋上蓋玻片後，玻片與技術器的間距恰好為0.1mm，故每小格的體積等於0.00025mm^3。滴入菌液蓋上玻片，使菌液充滿計數器凹槽中，計算方格內菌體數量，即可求得單位體積樣品之總菌數(個/ml或個/cm^3)。 三、設備 器材 1.蓋玻片 6.試管 2.玻璃(塑膠)滴管　　　　 7.衛生紙 3.酵母菌 8.血球計數器 4.標籤紙 9. 拭鏡紙 5.燒杯 儀器 1.恆溫培養箱 四、操作步驟 1.紀錄菌種之來源，本實驗為用市售酵母菌 2.取0.5克的酵母粉加於50ML培養液中，搖晃均勻 3.將酵母菌液進行連續10倍稀釋(我們是稀釋了了5次) 4.測定酵母菌分為兩種實驗流程 一.測吸光值： (a)利用UV-vis spectrophotometer測菌液之吸光值，波長要調至595nm (b)以培養液裝至比色管至8分滿，放入光譜儀中之凹槽進行歸零校正 (c)將比色管取出，加入液菌(8分滿)後，將測其吸光值，如要測許多濃度之菌液時，要從低濃度往高濃度方向測 (d)吸光值最好介於2~0.01之間，如果不同的稀釋倍數測出來的吸光值沒有改變太大時代表濃度已太高或太低，應捨棄不用。 二.以血球計數器算菌數： (a)首先了解血球計數器之用法及計算菌數之方式 (b)吸取稀釋好之菌液，滴於血球計數器之中央，蓋上專用蓋玻片(一樣是從低濃度往高濃度) (c)以顯微鏡觀察，並計算菌數(顯微鏡之用法為低倍數到高倍數) (d)血球計數器每一小格之體積為0.00025mm^3，16格則有 0.00025mm^3×16＝0.004mm^3＝0.000004cm^3 (e)換算成菌液菌數，各菌/cm^3 or各菌/Ml (f)最後以吸光值與菌數做圖，求其線性關係(例：Y＝AX+B及R^2) 實驗結果 十倍稀釋 吸光值 菌數總數 菌數/ml log值 10-1 1.009 190 4.75×107 7.68 10-2 0.198 10 2.5×106 6.40 10-3 0.082 2 0.5×106 5.70 10-4 0.075 2 0.5×106 5.70 10-5 0.072 0 0 無法計算 10-1十倍稀釋 菌數/ml 190 / (4 * 10-6) = 4.75×107 六、問題與討論 1.說明以直接計數法進行微生物計數之原理與優缺點為何 A:直接計數的目的為設計數並非觀察，所以只需能辦別出菌體即可。 其優點為方便、快速、節省時間；缺點無法辨識是否為微生物或是只是玻片上不清楚的黑影，部分微生物未能沉降或死亡狀態，以肉眼觀察計數的誤差極大。 2.計數時若小格格線上有微生物，為何不計每小格線左方和上方二線上之微生物，僅計每小格線右方和下方二線之細胞？ A:若酵母菌出芽之母子細胞當成一個細胞計算，細胞恰在線上者只計在方格右方及下方線上者，落於上方和左方者不計（四捨五入法）應避免重複計數。 3.由實驗過程說明一計數方法可能產生之實驗誤差的原因何在？如何減少誤差？ A:菌體尚未完成沉澱、菌液抹片不均勻、人為(肉眼)數菌誤差、顯微鏡與玻片可能有其他雜質汙染，盡量排除以上可能產生的誤差，在每一個方格應重覆數次求總平均值，並計算其為生物數量。 ４.說明如何以血球計數法直接計算微生物樣品之總菌數。 A:總菌數可經由以下公式推倒而得 (1)計算每一大方格之容積 ＝每一小方格之容積×16 ＝0.00025mm3 ×16 ＝4×10^-3mm3 ＝4×10^-6cm3 (2)每毫升樣品的總菌數為 16小格中之總數 每毫升樣品之菌總=　─────────────── 4×10-6 ＝１６小格微生物之總菌數×(2.5×１０5） 　　 心得 蘇智源：這次實驗用到的血球計數器和光學顯微鏡都是極為昂貴