基因克隆研究与利用.doc

基因克隆研究与利用 周涵滔 刘波 主编 基因克隆研究与利用 目 录 第一章 基因与基因表达 1 1.1基因的结构与功能 1 1.1.1 基因的结构 1 1.1.2基因的功能 2 1.2原核生物基因表达 3 1.2.1原核生物基因的转录与翻译 3 1.2.2 原核生物基因的启动子 6 1.2.3原核生物表达产物的分离纯化 9 1.3真核细胞基因表达 13 1.3.1酵母表达系统 13 1.3.2昆虫细胞表达系统 18 1.3.3哺乳动物细胞表达系统 18 第二章 基因操作与克隆 18 2.1基因重组技术 18 2.1.1限制性内切酶 18 2.1.2 克隆载体 18 2.1.3基因文库的构建与筛选 18 2.2基因诱变技术 18 2.2.1基因诱变的理论与方法 18 2.2.2 定点诱变与蛋白质改造 18 2.3 基因克隆技术 18 2.3.1 cDNA方法 18 2.3.3 利用PCR技术获得基因 18 2.3.4 基因的定位克隆法 18 第三章 生物基因组学研究 18 3.1 人类基因组计划 18 3.1.1 人类基因组计划产生的背景 18 3.1.2 人类基因组计划的任务 18 3.1.3 人类基因组计划的研究进展 18 3.1.4 人类基因组计划的深远影响 18 3.1.5 我国的人类基因组计划 18 3.2 其它物种基因组学研究 18 3.2.1 模式动物基因组学研究 18 3.2.2 模式植物基因组学研究 18 第四章 基因克隆的应用 18 4.1基因克隆在动物上的应用 18 4.2基因克隆在微生物上的应用 18 4.3基因克隆在植物上的应用 18 第五章 参考文献 18  第一章 基因与基因表达 1.1基因的结构与功能 1.1.1 基因的结构 DNA分子是一种双链的螺旋状分子。DNA链的基本单位是核苷酸。核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸基团三部分构成，碱基与脱氧核糖的第一位碳相连，而脱氧核糖的5＇碳又与一个磷酸基团相连(图1-1)。DNA链上的核苷酸可多可少，它们通过一个核苷酸的脱氧核糖的3＇羟基与另一个相邻的核苷酸的5＇磷酸基团之间形成磷酸二酯键而串联起来。由于碱基遵循互补的原则，所以一条DNA链上的核苷酸顺序决定了与它相配对的另一条DNA链上相对应的核苷酸顺序，后者也称为互补核苷酸链。这里所说的碱基有4种：腺嘌吟(A)、鸟嘌吟(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)(图1-2)。这4种碱基形成两种非常特异的配对形式，即A只与T配对，G只与C配对。在DNA的复制过程中，每一条已经存在的DNA链都可以作为模板合成新链，链上的脱氧核糖的3＇羟基通过酶促反应与要掺入的核苷酸的5＇磷酸形成磷酸二酯键从而使核苷酸依次加入(图1-3)，而且新合成的DNA双链仍然遵循碱基配对的原则。DNA双螺旋的两条链的方向实际上是相反的，人们也称之为反向平行。 图1-1 核苷酸的结构 图1-2 4种碱基的结构 一个双链DNA分子的长度通常用互补核苷酸对的数目来表达，也就是人们通常所说的碱基对(base pair，bp)。对于大的DNA分子通常用多少千个碱基对来表示，即kb(kilo base pairs)。当双链DNA分子超过几百万个碱基对时，人们就用百万碱基对，即Mb(mega base pairs)这个单位来描述它。 图1-3 DNA链的延伸 1.1.2基因的功能 生物体的结构和生化功能是由其体内的DNA中所包含的遗传信息决定的。作为遗传信息的基本单位，基因所携带的信息实际上是由核苷酸的排列顺序决定的，编码蛋白质的基因要通过两个生理过程才能解码。第一，编码蛋白质的基因(也称结构基因)作为模板产生RNA分子，即信使RNA(messenger RNA，mRNA)，这个过程称为转录(transcription)；第二，单个的mRNA分子在其他的细胞组分(包括核糖体、tRNA和酶)的帮助下合成蛋白质分子，这个过程称为翻译(translation)。 在转录过程中，以基因双链DNA中的一条链作为模板，DNA聚合酶会选择正确的核糖核苷酸(不是脱氧核糖核苷酸)，通过3＇→5＇磷酸二酯键把它们连起来。在RNA分子中，尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶，因此，在转录过程中尿嘧啶与腺嘌吟配对。虽然RNA分子有时会在分子内形成氢键，但总体来说RNA分子是单链分子。 在细菌等原核细胞中，结构基因通常指一个DNA片段，它可以转录产生mRNA分子，mRNA分子通过翻译合成细胞中所需的蛋白质(图1-4)。在真核细胞中，基因的结构就相对要复杂一些(图1-5)。真核基因的编码区域(exon，外显子)往